एकल-कक्ष Transcriptomic विश्लेषण माउस अग्नाशय अंत; स्रावी कोशिकाओं के
Summary
हम भ्रूण, नवजात और जन्मोत्तर अग्न्याशय एकल सेल आरएनए अनुक्रमण द्वारा पीछा से अंत में स्रावी कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन । इस विधि अग्नाशय अंत-स्रावी वंश विकास, सेल विविधता और transcriptomic गतिशीलता का विश्लेषण की अनुमति देता है ।
Abstract
अग्नाशय के अंत में स्रावी कोशिकाओं, जो टाप में संकुल रहे हैं, रक्त ग्लूकोज स्थिरता और ऊर्जा चयापचय को विनियमित. विभिन्न प्रकार के सेल टाप में, इंसुलिन स्रावित β कोशिकाओं सहित, भ्रूण के चरण के दौरान आम अंत-स्रावी progenitors से भेदभाव कर रहे हैं. अपरिपक्व स्रावी कोशिकाओं सेल प्रसार के माध्यम से विस्तार और एक लंबी जन्मोत्तर विकास अवधि के दौरान परिपक्व । हालांकि, इन प्रक्रियाओं अंतर्निहित तंत्र स्पष्ट रूप से परिभाषित नहीं हैं । एकल सेल आरएनए-अनुक्रमण अलग कोशिका आबादी के लक्षण वर्णन के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है और सेल वंश भेदभाव रास्ते अनुरेखण । यहाँ, हम भ्रूण, नवजात और जन्मोत्तर अग्न्याशय से पृथक अग्नाशय β कोशिकाओं के एकल सेल आरएनए-अनुक्रमण के लिए एक विधि का वर्णन ।
Introduction
अग्ंयाशय स्तनधारियों में एक महत्वपूर्ण चयापचय अंग है । अग्ंयाशय अंत में स्रावी और exocrine डिब्बों के शामिल है । अग्नाशय के अंत-स्रावी कोशिकाओं, सहित इंसुलिन का उत्पादन β कोशिकाओं और ग्लूकागन उत्पादन α कोशिकाओं, आइलेट्स के टाप में एक साथ क्लस्टर और समन्वयन प्रणालीगत ग्लूकोज homeostasis को विनियमित. अंत में स्रावी कोशिकाओं के रोग मधुमेह में परिणाम है, जो एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य दुनिया भर में मुद्दा बन गया है ।
अग्नाशय स्रावी कोशिकाओं Ngn3+ progenitors से embryogenesis1के दौरान प्राप्त कर रहे हैं । बाद में, प्रसवकालीन अवधि के दौरान, अंत में स्रावी कोशिकाओं अपरिपक्व टाप बनाने के लिए पैदा करना । इन अपरिपक्व कोशिकाओं को विकसित करने के लिए जारी है और धीरे-2वयस्कों में रक्त ग्लूकोज homeostasis को विनियमित करने के लिए बड़े पैमाने पर हो जाता है जो परिपक्व टाप, बन जाते हैं ।
हालांकि transcriptional कारकों के एक समूह की पहचान की गई है कि β कोशिका विभेद को विनियमित, β कोशिकाओं के सटीक परिपक्वता मार्ग अभी भी अस्पष्ट है. इसके अलावा, β सेल परिपक्वता प्रक्रिया भी सेल संख्या विस्तार के विनियमन3,4 और सेलुलर विविधता5,6की पीढ़ी शामिल है । हालांकि, इन प्रक्रियाओं के नियामक तंत्र अच्छी तरह से अध्ययन नहीं किया गया है ।
एकल-सेल आरएनए-अनुक्रमण एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है कि प्रोफ़ाइल सेल उपआबादी और ट्रेस सेल वंश विकासात्मक रास्ते7कर सकते हैं । इस तकनीक का लाभ उठाते हुए, अग्नाशय के टाप डेवलपमेंट के दौरान होने वाली मुख्य घटनाओं को एकल-कक्ष स्तर8पर समझने में किया जा सकता है । एकल-सेल आरएनए-अनुक्रमण प्रोटोकॉल के बीच, स्मार्ट-seq2 बेहतर संवेदनशीलता और सटीकता के साथ पूर्ण लंबाई सीडीएनए की पीढ़ी की अनुमति देता है, और कम लागत9पर मानक रिएजेंट के उपयोग. स्मार्ट-seq210अनुक्रमण के लिए एक सीडीएनए पुस्तकालय का निर्माण करने के लिए लगभग दो दिन लगते हैं ।
यहाँ, हम प्रतिदीप्ति के अलगाव के लिए एक विधि का प्रस्ताव-लेबल β कोशिकाओं भ्रूण के अग्न्याशय से वयस्क Ins1-आरएफपी ट्रांसजेनिक चूहों11के लिए, प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष छँटाई का उपयोग (FACS), और पर transcriptomic विश्लेषणों का प्रदर्शन सिंगल-सेल स्तर, स्मार्ट-seq2 प्रौद्योगिकी (चित्रा 1) का उपयोग कर । इस प्रोटोकॉल को सामान्य, रोग और उम्र बढ़ने राज्यों में सभी अग्नाशय अंत-स्रावी कोशिका प्रकार के transcriptomes का विश्लेषण करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम अग्नाशय β कोशिकाओं के एकल सेल अभिव्यक्ति प्रोफाइल का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी और आसान करने के लिए उपयोग विधि का प्रदर्शन किया । इस विधि से भ्रूण, नवजात और जन्मोत्तर अग्न्याशय स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम राष्ट्रीय प्रोटीन विज्ञान, बीजिंग (पेकिंग विश्वविद्यालय) और जीवन विज्ञान कंप्यूटिंग मंच के लिए पेकिंग-Tsinghua केंद्र के लिए केंद्र का धंयवाद । इस काम को चीन के विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (2015CB942800), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (३१५२१००४, ३१४७१३५८, और ३१५२२०३६), और पेकिंग-Tsinghua केंद्र से जीवन विज्ञान के लिए सी के लिए वित्त पोषण के द्वारा समर्थित किया गया था R.X.
Materials
| Collagenase P | Roche | 11213873001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz | RS-4904 | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5058 | |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereo Fluorescence microscope | Zeiss | Stereo Lumar V12 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD-Falcon | 352235 | |
| 96-Well PCR Microplate | Axygen | PCR-96-C | |
| Silicone Sealing Mat | Axygen | AM-96-PCR-RD | |
| Thin Well PCR Tube | Extragene | P-02X8-CF | |
| Cell sorter | BD Biosciences | BD FACSAria | |
| Capillary pipette | Sutter | B100-58-10 | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Life Technologies | 4456740 | |
| Distilled water | Gibco | 10977 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara | 2313 | |
| Superscript II reverse transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| First-strand buffer (5x) | Invitrogen | 18064-014 | |
| DTT | Invitrogen | 18064-014 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 107-43-7 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9932 | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| VAHTS DNA Clean Beads XP beads | Vazyme | N411-03 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| AceQ qPCR SYBR Green Master Mix | Vazyme | Q121-02 | |
| TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina | Vazyme | TD502 | Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE |
| TruePrep Index Kit V3 for Illumina | Vazyme | TD203 | Include 16 N6XX and 24 N8XX |
| High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit | Advanced Analytical Technologies | DNF-474 | |
| 1x HBSS without Ca2+ and Mg2+ | 138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 0.44 mM KH2PO4 |
||
| Isolation buffer | 1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4 | ||
| FACS buffer | 1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3' | ||
| TSO | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3' | ||
| ISPCR primers | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' | ||
| Gapdh Forward primer | 5'-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3' | ||
| Gapdh Reverse primer | 5'-GCCTTGACTGTGCCGTTGAAT-3' | ||
| Ins2 Forward primer | 5'-TGGCTTCTTCTACACACCCA-3' | ||
| Ins2 Reverse primer | 5'-TCTAGTTGCAGTAGTTCTCCA-3' |
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