Summary
Se describe un método para el aislamiento de las células endocrinas del páncreas embrionarios, neonatales y postnatales seguidos por la secuencia de RNA unicelular. Este método permite el análisis del desarrollo del linaje endocrino pancreático, de células dinámicas heterogeneidad y transcriptómicos.
Abstract
Las células endocrinas pancreáticas, que se agrupan en islotes, regulan la estabilidad de la glucosa sanguínea y el metabolismo energético. Los tipos de células distintos en islotes, incluyendo células β secretoras de insulina, se distinguen de los comunes progenitores endocrinos durante la fase embrionaria. Inmaduras células endocrinas amplían a través de la proliferación celular y maduran durante un periodo de desarrollo postnatal largo. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a estos procesos no están claramente definidos. Sola célula secuenciación del RNA es un enfoque prometedor para la caracterización de poblaciones celulares distintas y las vías de diferenciación de seguimiento celular linaje. Aquí, describimos un método para la secuenciación del RNA unicelular de células β pancreáticas aisladas de páncreas embrionarios, neonatales y postnatales.
Introduction
El páncreas es un órgano vital metabólico en mamíferos. El páncreas está compuesto por compartimientos endocrinos y exocrinos. Las células endocrinas pancreáticas, incluyendo las células β productoras de insulina y células productoras de glucagón α, se agrupan juntos en los islotes de Langerhans y coordinadamente regulan la homeostasis de la glucosa sistémica. Resultados de la disfunción de las células endocrinas en la diabetes mellitus, que se ha convertido en un problema de salud pública importante en todo el mundo.
Las células endocrinas pancreáticas derivan de Ngn3+ progenitores durante embriogénesis1. Más tarde, durante el período perinatal, las células endocrinas proliferan a islotes inmaduro forma. Estas células inmaduras continúan desarrollar y gradualmente se convierten en islotes de madurados, que se convierten en ricamente vascularizados para regular la homeostasis de la glucosa de sangre en adultos2.
Aunque se ha identificado un grupo de factores transcripcionales que regulan la diferenciación de la célula β, el camino preciso de la maduración de las células β es todavía confuso. Además, el proceso de maduración de la célula β implica también la regulación de la célula número expansión3,4 y la generación de heterogeneidad celular5,6. Sin embargo, los mecanismos de regulación de estos procesos no han sido bien estudiados.
Sola célula secuenciación del RNA es un enfoque potente perfil subpoblaciones celulares y traza de vías del desarrollo de linaje celular7. Tomando ventaja de esta tecnología, la clave de los eventos que ocurren durante el desarrollo de islotes pancreáticos pueden ser descifrados en el nivel unicelular8. Entre los protocolos de la secuencia de RNA unicelular, Smart-Sec2 permite la generación de cDNA de larga duración con mejor sensibilidad y precisión y el uso de reactivos estándar en menor costo9. Smart-Sec2 tarda aproximadamente dos días para construir una biblioteca de cDNA de la secuencia10.
Aquí proponemos un método para el aislamiento de las células β marcados con fluorescencia desde el páncreas del feto adulto Ins1 RFP ratones transgénicos11usando celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación, y el rendimiento de transcriptómicos analiza en el sola célula nivel, usando la tecnología Smart-Sec2 (figura 1). Este protocolo puede extenderse para analizar los transcriptomas de todos los tipos de células endocrinas pancreáticas en Estados normales, patológicos y el envejecimiento.
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Protocol
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Pekín.
1. páncreas aislamiento
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Para embriones E17.5 (día embrionario 17.5):
- Estimar embrionario día 0.5 basado en el momento cuando aparece el tapón vaginal.
- Sacrificar a los ratones embarazados por la administración de CO2 . Rocíe la piel abdominal con alcohol al 70%.
- Haga una incisión en forma de V con tijera de la ampliación de la zona genital a las costillas. Este proceso abrirá completamente la cavidad abdominal.
- Disecar el útero fuera de la cavidad abdominal y colocar en un plato de 10 cm que contiene PBS frío.
- Diseccionar los embriones del útero con pinzas con punta fina bajo un estereomicroscopio, eliminación de otros tejidos, como la placenta y del cordón umbilical. Coloque todos los embriones en un plato de 10 cm que contiene PBS frío.
- Rasgar abierto la cavidad abdominal de los embriones y sacar el tejido visceral con una pinza de codo. Transferir el tejido visceral en un plato de fondo negro de 6 cm que contiene PBS frío.
- El páncreas está situado en la parte superior izquierda del abdomen y se conecta al estómago, el bazo y el duodeno (línea amarilla punteada en la figura 2A)12. Separar el páncreas de los tejidos viscerales con unas pinzas y el tejido pancreático de la piscina juntos en un frasco de 20 mL que contiene 5 mL de solución de colagenasa frío 0,5 mg/mL: colagenasa de 0.5 mg/mL P en tampón de aislamiento (HBSS conteniendo 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2 5 mM de glucosa, pH 7.4).
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Para los ratones de la P0-P15 (día postnatal 0-15):
- Sacrificio y fijar el ratón adhiriendo a las extremidades a un pedazo de banco protector con cinta. Rocíe la piel abdominal con alcohol al 70%.
- Abrir completamente la cavidad abdominal como se describe en el paso 1.1.3. Tire el intestino hacia fuera y al lado izquierdo del ratón. Este procedimiento expone los lóbulos esplénicos, gástricos y duodenales del páncreas. Diseccionar todos los lóbulos del páncreas (figura 2B)12 y piscina el tejido pancreático juntos en un frasco de 20 mL que contiene 5 mL de solución de colagenasa frío 0,5 mg/mL.
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Para los ratones P18-P60 (día postnatal 18-60):
- Preparar la solución de la colagenasa. Mantenga en hielo hasta que esté listo para su uso.
- Sacrificar el ratón y abrir la cavidad abdominal, como se mencionó anteriormente (paso 1.1.2 y 1.1.3).
Nota: No hacen daño al hígado, cualquier herida en el hígado se reduzca la presión de flujo en el conducto biliar y reducir la eficacia de la perfusión del siguiente paso. - Retire el xifoides. Tire el intestino y a la derecha del ratón y empuje los lóbulos mediales derecho e izquierdos del hígado a cada lado para exponer la vesícula biliar (flecha blanca en la figura 2) y el conducto biliar común.
- Sujete el duodeno con un par de vasos de abrazaderas en la posición superior e inferior, que flanquean el sitio donde el conducto biliar entra en el duodeno (Figura 2D).
Nota: No fije los lóbulos del páncreas gástricos o esplénicos. La solución de colagenasa no fluirá en el lóbulo gástrico y esplénico del páncreas en el paso siguiente si la sujeta. - Llene una jeringa con 5 mL de 0.5 mg/mL de solución de colagenasa frío e inserte una aguja de 30 G en la vesícula biliar. Con cuidado y suavemente, manipular la aguja a través del conducto biliar común.
- Perfusión del páncreas mediante la inyección de 1 – 5 mL de solución fría colagenasa de 0.5 mg/mL, dependiendo del tamaño del ratón. La inyección debe ser lenta y constante para evitar que la aguja se deslice fuera del conducto y para evitar que el intestino reviente bajo alta presión de líquido. La inyección es completa cuando el páncreas se expande completamente.
- Diseccionar el páncreas (la línea amarilla punteada en la Figura 2D) fuera de la cavidad abdominal utilizando fórceps inmediatamente después de la perfusión. Coloque el tejido en un frasco de 20 mL que contiene 5 mL de solución de colagenasa frío 0,5 mg/mL. Si manipular más de un ratón a la vez, inundar los ratones uno por uno y los tejidos de la piscina en solución de colagenasa frío en un frasco de 20 mL hasta que todos los ratones han sido disecados.
2. colagenasa digestión y aislamiento de islotes pancreáticos
- Coloque el frasco de 20 mL que contiene el tejido pancreático en un baño de agua de 37 ° C e incubar durante 3 minutos equilibrar la temperatura.
- Agitar suavemente el tubo para otros 3 a 5 minutos. Si el tejido pancreático está totalmente inflado, poco a poco se disocian en pedazos pequeños de tejido hasta que finalmente se dispersa uniformemente. El tiempo de digestión varía dependiendo del tamaño del páncreas y la eficacia de la perfusión.
- Filtrar el producto digerido a través de un filtro de nylon de 0.25 mm en un nuevo tubo de centrífuga de 50 mL. Fondo Lave el filtro usando una jeringa de 20 mL con PBS helado.
- Para páncreas E17.5-P15, vaya al paso 3.1.
- P18-P60 páncreas, centrifugar a 200 x g durante 1 min y descartar el sobrenadante. Vuelva a suspender el tejido con PBS frío.
- Vierta 5 mL de la suspensión de tejido en un fondo negro 6 cm. Los islotes pancreáticos son estructuras blanco lechosas, pequeño y compactas y tejido acinar es flojo y translúcido blanco. Elegir islotes con pipeta 200 μL y transferirlos a un tubo de 1,5 mL que contiene una pequeña cantidad de PBS frío.
3. tripsina digestión de tejidos pancreáticos o islotes
- Centrifugar el tubo que contiene el tejido pancreático o islotes a 200 x g durante 1 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante sin perturbar el pellet.
- Resuspender el sedimento con 0.25% tripsina-EDTA e incubar en un baño de agua de 37 ° C. Después de 4 min de incubación, suavemente y de vez en cuando aspire (pipeta) durante 1 min, utilizando 200 μL puntas.
Nota: Para el páncreas E17.5-P3, añadir 1 mL de tripsina-EDTA. Para páncreas P4-P15, añadir 3 mL de tripsina-EDTA. 100-300 islotes, añadir 1 mL de tripsina-EDTA. Ajustar el volumen de tripsina-EDTA según la cantidad de tejido. - Detener la digestión mediante la adición de volumen de x 0,4 de frío suero bovino fetal (FBS) y mezclar por vortex suave.
- Centrifugar a 250 x g durante 3 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante sin perturbar el pellet.
- Resuspender las células con tampón FACS frío de 200 μL (HBSS conteniendo 1% FBS, pH 7,4). Transferir las células a un tubo de 5 mL FACS.
- Rápidamente gira el tubo de FACS para permitir la suspensión de células a pasar por el filtro para eliminar los restos de tejido grandes sin digerir. La suspensión de células individuales en el tubo ya está lista para la clasificación de FACS.
4. sola célula Lysis
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Preparar el tampón de lisis celular.
Nota: Realizar todos los experimentos bajo una campana de esterilización UV con flujo laminar. Todos los tubos, placas y puntas de pipeta deben ser Rnasa DNasa- libre. Descontamine la campana y pipetas solución lejos de Rnasa antes de su uso.- Descongelar los reactivos en el hielo: dNTP (10 mM), cartilla de oligo-dT (10 μM) y ERCC stock solución (1:20).
- Diluir la ERCC 1:5 x 105 con agua libre de nucleasa.
- Calcular el volumen de tampón de lisis de la célula necesitada. Agregar 0.1 μL de inhibidor de Rnasa (40 U/μL), 1.9 μL de 0.2% (vol/vol) Tritón X-100, 1 μL de dNTP, 1 μL de cebador oligo-dT y 0.05 μL de ERCC diluido a un volumen final de 4.05 μL de cada celda.
- Alícuota del tampón de lisis celular en tubos de PCR de 0.2 mL pared delgada 8 rayas o placas de 96 pocillos. Centrifugar los tubos o placas para 30 s a 4 ° C.
Nota: Centrifugar tubos de PCR de 0.2 mL pared delgada raya 8 a 7500 x g y placas de 96 pocillos en 800 g de x en los siguientes pasos.
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Sola célula cosecha y lisis.
- Manualmente pick FACS clasifica las células Ins1-RFP+ en tampón FACS en tira de 8 tubos PCR con una pipeta capilar de 30 a 40 μm, u ordenar directamente las células Ins1-RFP+ en placas de 96 pocillos. El volumen que contiene una sola célula se considera menos de 0,3 μL.
Nota: Uso forward scatter (FSC-H) de altura vs avance área de scatter (FSC-A) bloquea estrategia de discriminación de doblete, FSC-H vs lado área de dispersión (SSC-A) para la ruina y fluorescencia gating Ins1-RFP+ celular (Figura 3A-3C) clasificación. Para el método de cosecha, clasificar las células blanco en un tubo de 1,5 mL con 300 μL tampón de FACS. La concentración final adecuada es 5-10 células/μL. Ayuste el volumen de tampón. Para el método de colección de placa, ordenar una sola celda en cada pocillo de una placa de 96 pocillos siguiendo el manual del instrumento. 7 , 13 - Vórtex los tubos o placas para lyse las células y liberar el ARN. Centrifugar los tubos o placas para 30 s a 4 º C e inmediatamente coloca en hielo.
Nota: Las células pueden almacenarse a-80 ° C durante una semana.
- Manualmente pick FACS clasifica las células Ins1-RFP+ en tampón FACS en tira de 8 tubos PCR con una pipeta capilar de 30 a 40 μm, u ordenar directamente las células Ins1-RFP+ en placas de 96 pocillos. El volumen que contiene una sola célula se considera menos de 0,3 μL.
5. unicelular cDNA amplificación
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Transcripción reversa (RT).
- Descongelar los reactivos de RT (tabla 1) en el hielo.
- Incubar las muestras a 72 ° C por 3 min y poner de inmediato los tubos o placas de hielo durante al menos 1 min brevemente Centrifugue los tubos o placas para 30 s a 4 ° C.
Nota: Utilice un termociclador con una tapa de 105 ° C calentado para incubaciones todos. - Preparar la mezcla de RT para todas las reacciones, como se describe en la tabla 1.
- Dispense 5.7 μL de mezcla de RT a cada muestra para llevar el volumen a un total de 10 μL. Suavemente la mezcla de vortex y centrifugar durante 30 s a 4 ° C.
- Coloque las muestras en un termociclador e inicia el programa de RT como sigue: 42 ° C por 90 min, 10 ciclos (50 ° C por 2 min, 42 ° C por 2 min), 70 ° C por 15 minutos y mantenga a 4 º C.
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La amplificación por PCR.
- Descongelar los reactivos de PCR (tabla 2) en el hielo.
- Preparar la mezcla PCR para todas las reacciones, como se describe en la tabla 2.
- Dispensar 15 μL de la mezcla PCR para cada muestra, que contiene las reacciones de primera línea. Suavemente la mezcla de vortex y centrifugar durante 30 s a 4 ° C.
- Coloque las muestras en un termociclador y comenzar el siguiente programa PCR: 98 ° C por 3 min, 18 ciclos (98 ° C por 20 s, 67 ° C por 15 s, 72 ° C durante 6 min.), 72 ° C por 5 min y mantener a 4 ° C.
Nota: El producto PCR puede almacenarse a 4 ° C durante menos de una semana o a-20 ° C /-80 ° C hasta por 6 meses.
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Purificación de la polimerización en cadena.
- Añadir 25 μL de suspende de nuevo cuentas de purificación de ADN (1 x) para cada muestra del paso anterior y mezclar bien por vortex. Entonces, rápidamente hacer girar el tubo o placas a temperatura ambiente para recoger el líquido, pero evite la solución de los abalorios.
Nota: Equilibrar cuentas de purificación de ADN a temperatura ambiente durante 15 minutos y agitar bien antes de usar. - Incubar por 5 min a temperatura ambiente.
- Lugar el tubo o placa en un magnética hasta que la solución es clara, entonces cuidadosamente retire y descarte el sobrenadante.
- Añadir 200 μL de etanol de 80% recién preparado para lavar los granos mientras que en el soporte magnético, incube durante 30 s, luego retire con cuidado y deseche la solución de etanol.
Nota: La solución de etanol 80% (vol/vol) debe estar preparada fresco cada vez. - Repita el paso 5.3.4 para un total de dos lavados.
- Cuidadosamente retire y deseche el resto de solución de etanol y aire secan los granos mientras que el tubo o placa es en soporte magnético.
Nota: Evitar que se sequen demasiado los granos para asegurar la eficacia máxima de la elución. - Añadir 11 μL de agua libre de nucleasa para eluir el destino del ADN de los granos y mezclar por vortex. Entonces, rápidamente hacer girar el tubo o placa y colocarlo en un soporte magnético hasta que la solución es clara. Transferir 10 μL de la muestra a un nuevo tubo PCR.
Nota: Si existen dímeros después de una sola ronda de purificación, basado en la detección de distribución de tamaño de cDNA, purificar nuevamente para eliminar totalmente los dímeros. Los dímeros pueden influir en el cálculo de la producción de cDNA si permanecen en la muestra.
- Añadir 25 μL de suspende de nuevo cuentas de purificación de ADN (1 x) para cada muestra del paso anterior y mezclar bien por vortex. Entonces, rápidamente hacer girar el tubo o placas a temperatura ambiente para recoger el líquido, pero evite la solución de los abalorios.
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Control de calidad del cDNA.
- Elegir al azar las muestras para detectar la producción total de cDNA usando un fluorómetro.
- Evaluar los niveles de expresión del gen marcador por PCR en tiempo real (qPCR) (figura 4E). Quitar 1 μL de la muestra y diluir 40 veces y realizar qPCR utilizando una placa de 384 pozos. Preparar la mezcla de qPCR como se describe en la tabla 3. Condiciones de ciclismo: 95 ° C durante 10 min, 45 ciclos (95 ° C durante 10 s, 60 ° C durante 15 s, 72 ° C por 15 s).
- Elegir al azar las muestras para detectar la distribución de tamaño utilizando un instrumento de electroforesis capilar en paralelo.
6. construcción de la biblioteca de cDNA
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Reacción de Tagmentation por el Tn5 transposasa.
- Detectar el rendimiento total de cDNA de células seleccionadas de qPCR de paso 5.4.2 con un fluorómetro. Uso 2 ng de cDNA como material de partida.
- Descongelar los reactivos de la reacción de tagmentation (tabla 4) en el hielo.
- Preparar la reacción de tagmentation en un tubo PCR 0.2 mL pared delgada 8-raya, como se describe en la tabla 4y mezclar cuidadosamente en el vórtex. Luego, girar rápidamente por la solución a temperatura ambiente.
- Incubar las muestras a 55 ° C durante 10 minutos y mantener a 4 ° C.
- Inmediatamente añadir 2 μL de TS x 5 para cada muestra que contiene el tagmented ADN para detener la reacción. Mezclar cuidadosamente por vortex y luego girar rápidamente por la solución a temperatura ambiente.
- Incubar la mezcla durante 5 minutos a temperatura ambiente. El ADN debe procesarse inmediatamente para el enriquecimiento final PCR.
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Amplificación de fragmentos de ligarse por el adaptador.
- Descongelar los reactivos de PCR (tabla 5) en el hielo.
- Preparar la mezcla PCR de enriquecimiento, como se describe en la tabla 5y mezclar cuidadosamente en el vórtex. Luego, girar rápidamente por la solución a temperatura ambiente.
- Llevar a cabo la polimerización en cadena con el siguiente programa: 72 ° C por 10 min, 98 ° C por 30 s, 8 ciclos (98 ° C por 15 s, 60 ° C durante 30 s, 72 ° C por 3 min), 72 ° C por 5 min y mantener a 4 ° C.
Nota: El número de ciclos depende de la cantidad de ADN de la biblioteca prevista.
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Purificación de PCR con selección de tamaño.
- Añadir 14 μL de granos de purificación de ADN suspendidos de nuevo (x 0.7) para cada muestra del paso anterior y mezclar bien por vortex. Entonces, rápidamente hacer girar el tubo a temperatura ambiente para recoger el líquido, pero evite la solución de los abalorios.
Nota: Equilibrar cuentas de purificación de ADN a temperatura ambiente durante 15 minutos y agitar bien antes de usar. - Incubar por 5 min a temperatura ambiente.
- Coloque el tubo sobre un soporte magnético apropiado hasta que la solución es clara, cuidadosamente transferir el sobrenadante a una nueva tira de tubo y descartar la anterior banda de tubo.
- Agregar 3 μL de suspende de nuevo cuentas de purificación de ADN (0.15 x) a cada muestra en la banda tubo y mezcle bien por vortex. Entonces, rápidamente hacer girar el tubo a temperatura ambiente.
- Incubar por 5 min a temperatura ambiente.
- Lugar el tubo o placa en un magnética hasta que la solución es clara, entonces cuidadosamente retire y descarte el sobrenadante.
- Añadir 200 μL de etanol de 80% recién preparado para lavar los granos mientras que en el soporte magnético, incube durante 30 s, luego retire con cuidado y deseche la solución de etanol.
Nota: La solución de etanol 80% (vol/vol) debe estar preparada fresco cada vez. - Repita el paso 6.3.7 para un total de dos lavados.
- Cuidadosamente retire y deseche el resto de solución de etanol y aire secan los granos mientras que el tubo o placa es en soporte magnético.
Nota: Evitar que se sequen demasiado los granos para asegurar la eficacia máxima de la elución. - Añadir 11 μL de agua libre de nucleasa para eluir el destino del ADN de los granos y mezclar por vortex. Entonces, rápidamente hacer girar el tubo o placa y colocarlo en un soporte magnético hasta que la solución es clara. Transferir 10 μL de la muestra a una banda nueva de tubo.
- Añadir 14 μL de granos de purificación de ADN suspendidos de nuevo (x 0.7) para cada muestra del paso anterior y mezclar bien por vortex. Entonces, rápidamente hacer girar el tubo a temperatura ambiente para recoger el líquido, pero evite la solución de los abalorios.
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Control de calidad de la biblioteca del cDNA final.
- Medir la concentración de cada biblioteca con un fluorómetro y verificar la distribución de tamaño utilizando un instrumento de electroforesis capilar en paralelo.
Nota: El rendimiento de ADN es normalmente entre 15-25 ng de cada biblioteca. Los fragmentos que van desde 250 bp a 450 bp se observará. Si dímeros permanecen después de la purificación, según lo confirmado por el control de la distribución de tamaño, purificar con 1 x granos de purificación de ADN una vez más.
- Medir la concentración de cada biblioteca con un fluorómetro y verificar la distribución de tamaño utilizando un instrumento de electroforesis capilar en paralelo.
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Agrupación de biblioteca
- Basado en el tamaño del fragmento aproximado, de cantidades iguales de la piscina del ADN de cada muestra, asegurándose que ninguno de ellos contiene las mismas combinaciones de adaptadores N6XX y N8XX.
7. secuencia de ADN
- Tema bibliotecas de código de barras para 51 secuencia de fin single bp utiliza un sistema de secuenciación de alto rendimiento. Realizar la secuenciación siguiendo el protocolo del fabricante. La profundidad de la secuencia de cada célula es aproximadamente 1 millón en promedio Lee8, Lee al menos 0,5 millones por celular14.
8. bioinformática análisis
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Evaluación de la calidad de la secuencia y la alineación.
- Evaluar la calidad de la secuencia Lee con FastQC (v0.11.3)15 de los siguientes parámetros: "fastqc - extracto -o output_dir input_fastq".
- El genoma del ratón se funden con las secuencias de la ERCC mediante el comando "cat mm10.fa ERCC.fa > mm10_ERCC.fa".
- Construir bowtie2 (v2.2.5)16 índice con los siguientes parámetros: "construir bowtie2 mm10_ERCC.fa mm10_ERCC".
- Alinear utilizando tophat2 Lee (2.1.0)17 con los siguientes parámetros: "tophat2 -o output_dir -G gene.gtf - transcriptoma-index trans_index mm10_ERCC input_fastq".
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Cuantificar los niveles de expresión génica.
- Lee cuenta asignada para cada gen usando HTSeq (v 0.6.0)18 con los siguientes parámetros: '' htseq-Conde - f bam - r pos -s no - a 30 gene.gtf de accepted_hits.bam > read_count.txt''.
- Normalizar los niveles de expresión génica de las transcripciones por millones (TPM)19.
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Control de calidad de las células.
- Excluir las células con menos de 0,5 millones de lecturas asignadas o menos de 4.000 genes (TPM > 1).
Nota: el criterio de exclusión depende de los tipos de la célula y la profundidad de la secuencia. - Conservar las células que expresan marcadores endocrinos (por ejemplo, Ins1 para las células β, Gcg para células α) y excluir las células que expresan marcadores no-endocrina (e.g., Spi1 para leucocitos).
- Excluir las células con menos de 0,5 millones de lecturas asignadas o menos de 4.000 genes (TPM > 1).
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Análisis de componentes principales (PCA)
- Identificar genes altamente variables según ERCC punto-ins, como se describió anteriormente20.
- Realizar PCA usando la función "PCA" en la R paquete FactoMineR (v1.31.4)21, con el log2(TPM + 0.1) de genes altamente variables.
- Visualizar los resultados PCA con ggplot2 (v2.0.0)22.
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Jerárquico de agrupamiento.
- Identificar genes con las más altas cargas de componentes principales (PC) utilizando la función "dimdesc" FactoMineR (v1.31.4)21.
- Realizar clustering jerárquico con la función "heatmap.2" en el paquete de R gplots (v3.0.1)23, log2 (TPM + 1) valores relativos de PC alta carga de genes.
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Representative Results
Se disecaron páncreas de ratones embrionarios, neonatales y postnatales (figura 2A y 2B). Para los ratones mayores de postnatal día 18, el efecto digestivo depende del grado de perfusión; por lo tanto, la inyección es el paso más importante para el aislamiento de islotes pancreáticos (figura 2-2E y tabla 6). Se inyectó tanto colagenasa como fue posible llenar el páncreas durante este paso. El páncreas totalmente inflado se muestra en la Figura 2D. Si la perfusión no es exitoso (Figura 2E), pero la muestra es preciosa, el páncreas puede ser rasgado en pedazos pequeños para la digestión suficiente más tarde.
Después de la perfusión, el tejido pancreático fue digerido en pequeños pedazos para liberar islotes (figura 2F). Para acortar el tiempo de clasificación de FACS, hemos enriquecido las células endocrinas escogiendo los islotes de antemano. El tamaño de los islotes puede variar dependiendo de la edad del ratón y la intensidad de la digestión. En ocasiones, los islotes no son forma redondos. Islotes deben seleccionarse según el color y estado compacto (figura 2 y tabla 6). Si la cepa de ratón transgénico tiene un gen reportero, como GFP o RFP de células endocrinas, los islotes también podrían ser recogidos bajo un microscopio de fluorescencia.
Se purificaron células Ins1-RFP+ por FACS clasificación (Figura 3A-3 C), y entonces las células fueron recogidas con una pipeta capilar de unicelular RNA-seq (figura 3D). CDNA amplificado con éxito debe tener una longitud total por encima de 500 bp y enriquecerse de 1,5 kb a 2 kb. Por otra parte, suele haber un enriquecimiento de bp de 500-600 de cDNA observado en las células Ins1-RFP+ , que pueden representar las transcripciones de insulina (Figura 4A). Sin embargo, ha habido algunas situaciones anómalas observadas10 (tabla 6). Por ejemplo, los fragmentos de cDNA cerca de 100 bp son dímeros de primer (Figura 4B), que generalmente son causadas por las excesiva cartillas, que deben eliminarse repitiendo el paso de purificación de ADN. La existencia de dímeros de primer puede influir en los cálculos de los rendimientos de cDNA total, que se utilizan para la siguiente construcción de biblioteca. Los fragmentos de cDNA entre 100 PB y 500 bp suele representar degradados cDNA (figura 4), que es causada por células mal estado o reactivo problemas como contaminación de Rnasa. Bajo esta condición, debemos identificar la causa de la degradación del ADN y excluir el disturbio. Por ejemplo, para garantizar el estado de buena célula, los tejidos deben ser digeridos y células deben ordenarse rápidamente y suavemente, y operaciones deben realizarse con precaución para evitar cualquier tipo de contaminantes.
Después de la purificación de las bibliotecas de cDNA para la secuencia, se obtuvieron fragmentos de cDNA de diferentes tamaños, siguiendo las instrucciones para añadir diferentes proporciones de granos de la purificación de ADN a la muestra. Por ejemplo, podemos obtener cDNA desde 250 bp 450 bp por adición x 0,7 y 0,15 x granos de purificación de ADN a la primera y segunda rondas de purificación, respectivamente (figura 4). Este paso tiene una alta tasa de éxito. Sin embargo, si hay fragmentos de aproximadamente 100 bp, se sugiere para purificar las bibliotecas nuevo con 1 x granos de purificación de ADN para eliminar dímeros (tabla 6). Dímeros debidos a sesgar la cuantificación de ADN e influirán la muestra agrupamiento de resultados, que se traduce en la adquisición irregular de datos de cada muestra.
Se analizaron los datos de secuenciación con los enfoques de la Bioinformática (figura 5A). Las puntuaciones de calidad de la secuencia deben ser superiores a 30 durante la secuencia de evaluación de la calidad (figura 5B). Después de la alineación, se espera que 80-90% de lecturas asignadas para el genoma de referencia. Para obtener células de alta calidad para los análisis posteriores, excluidas las células con menos de 0,5 millones de lecturas asignadas o con menos de 4.000 detectar genes (figura 5 y 5 D). Después de PCA y clustering jerárquico, caracterizan diferentes grupos de células e identifica los genes que se expresan heterogéneo en grupos8.
Figura 1: Descripción esquemática para RNA-seq de unicelular de células endocrinas pancreáticas de ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: disección del páncreas, perfusión y picking islote. (A) disección de tejido pancreático embrionario (inferior) de un embrión E17.5 (superior). La línea amarilla punteada delimita el tejido pancreático. Barra de escala = 1.000 μm. (B) disección de tejido pancreático postnatal (derecha) de un ratón de P10 (izquierda). Barra de escala = 1.000 μm. (C-D) el tejido pancreático de ratón P60 antes (C) y después de la perfusión (D). La línea amarilla punteada delimita el tejido pancreático. Flecha blanca indica la vesícula biliar. (E) el tejido pancreático parcialmente inundado de un ratón P60. Flecha roja indica el área bien perfundido del páncreas. Flechas azules indica que las áreas pobremente perfundidas del páncreas. (F) el páncreas tejido antes (superior) y después de la digestión de colagenasa (inferior). (G) las flechas apuntan a los islotes que fueron lanzados de la colagenasa que digiere tejido pancreático. Barra de escala = 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: recoger manualmente las células con una pipeta capilar de 30 a 40 μm bajo un microscopio. (A-C) Paso a paso FACS compuerta para clasificar las células Ins1-RFP+ . (D) la brillante círculos indican las células y el tubo es una pipeta capilar. Seleccionar las celdas con mejor morfología (flecha) e ignorar las células agrupadas (flecha). Barra de escala = 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Detección de la calidad de distribución de tamaño de cDNA y biblioteca de las células Ins1-RFP+ por un instrumento de electroforesis capilar paralelo. Resultado de (A) el representante de cDNA con éxito previamente amplificado. Normalmente, el perfil de ADNc debe estar por encima de 500 bp con un pico de ~1.5–2 kb. (B) el resultado representativo del cDNA previamente amplificado con un pico de dímero de cartilla. El primer dímero es aproximadamente 100 BP (C) el perfil de pre amplificado cDNA con fragmentos entre 100 PB y 500 bp indica la posibilidad de degradación de cDNA. (D) la distribución de tamaño de cDNA biblioteca que oscilan entre los 250 bp y 450 bp que seguía los pasos de purificación mencionados en el presente Protocolo. (E) la expresión niveles de Ins2 en bibliotecas de cDNA por qPCR (izquierda) y relativa (derecho) de datos de la secuencia. Los Axes representan distintas 8 muestras de la célula. El eje y (izquierda) representa ΔCt normalizado respecto Gapdh (CtGapdh- CtIns2 + 6) y el eje y (derecha) representa expresión normalizado Ins2 respecto Gapdh (log2(TPM Ins2 / TPMGapdh)). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: bioinformática análisis de transcriptoma sola celda datos. (A) tubería de Bioinformática análisis. (B) secuenciación de puntuaciones de calidad a través de todas las bases de la Lee. (C) distribución de la cuenta de lectura asignada. (D) distribución de cuenta gen detectado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Componente | Volumen (μL) |
| De la transcriptasa reversa (200 U/μL) | 0.5 |
| Inhibidor de Rnasa | 0.25 |
| Primera-strand buffer (x 5) | 2 |
| TDT (100 mM) | 0.5 |
| Betaína (5 M) | 2 |
| MgCl2 (1 M) | 0.06 |
| TSO (100 ΜM) | 0.1 |
| Agua libre de nucleasas | 0.29 |
| Total | 5.7 |
Tabla 1: Reactivos de RT mezclar los componentes en una reacción 5.7 de μl de cada muestra.
| Componente | Volumen (μL) |
| Filamento de la primera reacción | 10 |
| Polimerasa de la DNA (ReadyMix x 2) | 12.5 |
| ES la primers PCR (10 μm) | 0.25 |
| Agua libre de nucleasas | 2.25 |
| Total | 25 |
Tabla 2: Reactivo de amplificación de la polimerización en cadena mezclar los componentes en una reacción en 25 μl de cada muestra
| Componente | Volumen (μL) |
| SYBR Green Master Mix | 5 |
| Cebadores (5 μm) | 0.5 |
| Agua libre de nucleasas | 2.5 |
| cDNA | 2 |
| Total | 10 |
Tabla 3: reactivo de qPCR mezclar los componentes en un 10 μl la reacción usando una estándar placa de 384 pozos.
| Componente | Volumen (μL) |
| 5 x TTBL | 1.6 |
| 2 ng cDNA | Variable |
| ddH2O | Variable |
| TTE mezcla V5 | 2 |
| Total | 8 |
Tabla 4: Reactivo de Tagmentation mezclar los componentes en la reacción 8 μl de cada muestra.
| Componente | Volumen (μL) |
| ddH2O | 1.6 |
| Producto del paso anterior | 10 |
| 5 x ficha | 4 |
| N6XX | 2 |
| N8XX | 2 |
| TAE | 0.4 |
| Total | 20 |
Tabla 5: Enriquecimiento PCR componentes de mezcla de reactivo en una reacción de 20 μl de cada muestra.
| Paso | Problema | Posibilidad de | Solución |
| 1.3.4 | Deslizamiento de las pinzas | La superficie externa del intestino está húmeda causado por la existencia de la pequeña cantidad de reducirse intersticial de líquido y collegenase | Cambiar suavemente la pared del duodeno y otras paredes de órgano en la cavidad abdominal con hisopos de algodón |
| 1.3.6 | Explosión del intestino | Presión del líquido es demasiado alta en el intestino | La velocidad de inyección |
| 2.6 | Islotes del palillo al tejido exocrino cuando recogiendo islotes | Insuficiente digestión | Prolongar la duración de la digestión y la sacudida fuerza |
| 5.3 | La producción de cDNA es baja después de la amplificación por PCR | Las células están en malas condiciones | Mantener las células frescas y en buen estado |
| 5.4 o 6.4 | Se observan dímeros de primer | Cartillas de excesiva | Purificar el cDNA una vez más con los granos de la purificación de ADN (0.8:1 o relación 1:1) |
| 5.4 | CDNA degradado después de la amplificación por PCR | Mala calidad de los reactivos contaminados o células | Mantener las células en buen estado o cambio de reactivos |
| 6.3 | La cantidad de ADN es baja después de la construcción de la biblioteca | Muy pocos ciclos PCR o la calidad del cDNA no es buena | Aumentar el número de ciclos o asegurar la calidad del cDNA antes de la construcción de la biblioteca |
Tabla 6: solución de problemas.
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Discussion
En este protocolo, hemos demostrado un método efectivo y fácil de usar para el estudio de los perfiles de expresión de la sola célula de las células β pancreáticas. Este método podría utilizarse para aislar las células endocrinas del páncreas embrionarios, neonatales y postnatales y realizar análisis transcriptómico de unicelulares.
El paso más crítico es el aislamiento de las células β solo en buen estado. Páncreas totalmente inundadas responden mejor a la digestión subsiguiente. Insuficiente perfusión, que generalmente se produce en el páncreas dorsal, resultará en un rendimiento bajo del islote. Después de la perfusión, el tiempo de digestión y sacudida de intensidad requieren especial atención. Sobre digestión, relativos a tiempos de incubación larga y vigorosa agitación, puede romper los islotes en pedazos. Insuficiente digestión los islotes no separará completamente de los tejidos adyacentes. Después de la digestión del páncreas, los islotes fueron purificados mediante recolección de mano en lugar de centrifugación de gradiente de densidad. Aunque centrifugación gradiente de densidad puede enriquecer islotes, erróneamente se descartan muchos islotes o islas conectadas con tejido acinar. Intente evitar escoger tejido acinar, que puede causar la digestión tripsina ineficiente y reducir la pureza de las células β.
Réplicas biológicas independientes son necesarias para distinguir los efectos biológicos de la variabilidad y por lotes. Si replica los dos biológicos tienen un patrón similar en PCA e incluyen subgrupos similares en resultados de clustering, estas muestras podrían revelar variabilidad biológica confiable. De lo contrario, réplicas biológicas adicionales se requieren para confirmar los resultados. Para un órgano metabólico tales como el páncreas, el estado de células asociado con el reloj circadiano24 puede explicar diferencias de lote. Para resolver este problema, recomendamos que recoge todas las muestras a la misma hora del día.
La limitación de este enfoque es bajo rendimiento porque tenemos que construir una biblioteca para cada celda. Debido a las excesiva cartillas en la reacción, el cDNA antes y después de la construcción de la biblioteca generalmente debe ser purificado dos veces para eliminar los dímeros de primer. Estos procesos son lentos. Recientemente, un protocolo modificado25 informó de que podría solucionar este problema hasta cierto punto. En el presente Protocolo, el código de barras específico de célula etiquetas fragmentos de cDNA durante el paso de transcripción reversa. Por lo tanto, el cDNA de cada celda pueden combinarse juntos y luego purificado, seguido por construcción de la biblioteca. Esta modificación aumenta significativamente el rendimiento de la construcción de la biblioteca. Sin embargo, este método modificado es menos sensible y detecta menos genes por célula. Además, este método es un 3' contar método con reducida cobertura leer. Por lo tanto, inteligente-Sec2 sigue siendo el método más adecuado para el desarrollo.
La preparación pancreática de otras especies puede ser diferente. Páncreas humano, los islotes pueden ser aislados después de anteriores protocolos26,27. Luego, los islotes aislados pueden ser disociados en las células28 y realizan análisis unicelular utilizando este método. Este método puede ser ampliamente aplicado a la investigación de desarrollo mamífero, las enfermedades y la regeneración.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos el Centro Nacional de Ciencias de la proteína, Beijing (Universidad de Pekín) y el centro Tsinghua de Pekín para la plataforma de computación de Ciencias de la vida. Este trabajo fue financiado por el Ministerio de ciencia y tecnología de China (2015CB942800), la nacional Ciencias naturales Fundación de China (31521004, 31471358 y 31522036) y financiación del centro Tsinghua de Pekín para Ciencias de la vida a C. R.X.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase P | Roche | 11213873001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz | RS-4904 | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5058 | |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereo Fluorescence microscope | Zeiss | Stereo Lumar V12 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD-Falcon | 352235 | |
| 96-Well PCR Microplate | Axygen | PCR-96-C | |
| Silicone Sealing Mat | Axygen | AM-96-PCR-RD | |
| Thin Well PCR Tube | Extragene | P-02X8-CF | |
| Cell sorter | BD Biosciences | BD FACSAria | |
| Capillary pipette | Sutter | B100-58-10 | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Life Technologies | 4456740 | |
| Distilled water | Gibco | 10977 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara | 2313 | |
| Superscript II reverse transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| First-strand buffer (5x) | Invitrogen | 18064-014 | |
| DTT | Invitrogen | 18064-014 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 107-43-7 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9932 | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| VAHTS DNA Clean Beads XP beads | Vazyme | N411-03 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| AceQ qPCR SYBR Green Master Mix | Vazyme | Q121-02 | |
| TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina | Vazyme | TD502 | Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE |
| TruePrep Index Kit V3 for Illumina | Vazyme | TD203 | Include 16 N6XX and 24 N8XX |
| High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit | Advanced Analytical Technologies | DNF-474 | |
| 1x HBSS without Ca2+ and Mg2+ | 138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 0.44 mM KH2PO4 |
||
| Isolation buffer | 1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4 | ||
| FACS buffer | 1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGTACT30VN-3' |
||
| TSO | 5'-AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGTACATrGrG+G-3' |
||
| ISPCR primers | 5'-AAGCAGTGGTAT CAACGCAGAGT-3' |
||
| Gapdh Forward primer | 5'-ATGGTGAAGGTC GGTGTGAAC-3' |
||
| Gapdh Reverse primer | 5'-GCCTTGACT GTGCCGTTGAAT-3' |
||
| Ins2 Forward primer | 5'-TGGCTTCTTC TACACACCCA-3' |
||
| Ins2 Reverse primer | 5'-TCTAGTTGCA GTAGTTCTCCA-3' |
References
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