La secuencia proviral individual completa (FLIPS) proporciona un método eficiente y de alto rendimiento para la amplificación y secuenciación de sola, cerca de larga duración (intactos y defectuosos) de provirus de HIV-1 y permite la determinación de su potencial capacidad de replicación. FLIPS supera limitaciones de anteriores ensayos diseñados para secuenciar la reserva latente de VIH-1.
El ensayo de largometraje individuales Proviral secuenciación (FLIPS) es un método eficiente y de alto rendimiento diseñado para amplificar y secuencia única, cerca de provirus de HIV-1 (intactos y defectuosos), integrales. FLIPS permite la determinación de la composición genética del HIV-1 integrado dentro de una población celular. A través de la identificación de defectos dentro de secuencias de HIV-1 proviral que ocurren durante la transcripción inversa, tales como canceladuras internas grandes, codones de parada deletéreos/hipermutación, mutaciones del mutágeno ‘ frameshift ‘ y mutaciones/deleciones en cis elementos temporarios requeridos para la maduración del virión, tirones pueden identificar provirus integrados capaces de replicación. El análisis de saltos pueden ser utilizado para identificar el provirus de HIV-1 que carecen de estos defectos y por lo tanto son potencialmente réplica-competente. Consiste en el protocolo de FLIPS: lisis de células infectadas por VIH-1, nested PCR de cerca integrales provirus VIH-1 (usando las cartillas para el VIH-1 5′ y 3’ LTR), purificación de DNA y cuantificación, preparación de biblioteca para Next generation Sequencing (NGS), NGS, Asamblea de novo de contigs proviral y un simple proceso de eliminación para identificar provirus réplica-competente. FLIPS ofrece ventajas sobre los tradicionales métodos diseñados para secuencia integran provirus VIH-1, como la secuencia proviral solo. FLIPS amplifica secuencias cerca de provirus integrales permitiendo la competencia de replicación que se determinará y también utiliza menos los cebadores de amplificación, previniendo las consecuencias de los desajustes de la cartilla. FLIPS es una herramienta útil para la comprensión del paisaje genético de provirus de HIV-1 integrados, especialmente dentro del reservorio latente, sin embargo, su utilización se puede extender a cualquier aplicación en que se requiere la composición genética del HIV-1 integrado.
Caracterización genética de la reserva latente de VIH-1, que persiste en personas en tratamiento antirretroviral a largo plazo (ART), ha sido vital para la comprensión de que la mayoría de los provirus integrados es defectuosos y replicación incompetente1 , 2. durante el proceso de transcripción reversa, se introducen errores en la secuencia proviral integradora. Algunos mecanismos que generan secuencias proviral defectuosas incluyen los errores de enzima de transcriptasa inversa de VIH-13, plantilla de conmutación4o5,de hipermutación APOBEC inducido6. Dos estudios recientes han encontrado que aproximadamente el 5% del provirus VIH-1 aisladas de individuos en el arte a largo plazo son genéticamente intacto y potencialmente réplica-competente y puede contribuir a la rápida recuperación en los niveles plasmáticos de VIH-1 sobre el abandono del hábito de arte 1 , 2 , 7. los estudios anteriores han identificado que provirus VIH-1 réplica-competente persisten en ingenuo y la reclinación memoria CD4+ T subconjuntos (incluyendo central, transicional y células de memoria T efectoras), indicando la importancia de la célula dirigidos a estas células en el futuro estrategias de erradicación2,8,9.
Primeras ideas sobre la distribución, dinámica y mantenimiento de la reserva latente de VIH-1 fueron alcanzados mediante la utilización de métodos de secuenciación solo proviral (SPS) que genéticamente caracterizar regiones sub-genómicas del VIH-1 genoma10 ,11,12,13. SPS es una herramienta versátil, capaz de secuenciar un provirus VIH-1 solo desde dentro de una sola célula infectada. Sin embargo, MSF es incapaz de determinar la capacidad de replicación de provirus, ya que sólo secuencias de sub-genomic provirus regiones y falta que contienen grandes deleciones dentro de sitios de unión del cebador. Un estudio anterior ha demostrado que SPS sobreestima el tamaño del depósito réplica-competente de 13 a 17 veces por secuenciación selectivamente las regiones sub-genómica intacta2.
Para abordar las limitaciones de los SP, Ho et al. 4 y Bruner et al. 1 desarrollado análisis de la secuencia cerca de larga duración provirus VIH-1. Esto permitió que la frecuencia de provirus de HIV-1 genéticamente intactos y potencialmente réplica-competente, en los individuos en el arte a largo plazo a ser determinado. Estos ensayos amplificado y secuenciado (vía Sanger secuenciación) sub-genomic regiones que luego se ensamblaron para obtener un provirus de HIV-1 secuencia del (intacta o defectuoso). Tres limitaciones de este enfoque son: 1) el uso de cebadores de secuencia múltiple aumenta el riesgo de involuntariamente introducir defectos en la secuencia proviral, 2) cartilla desajustes pueden prevenir la amplificación de provirus particular y 3) a menudo el toda secuencia proviral no puede resolverse debido a la tecnicidad de estos métodos.
Para superar las limitaciones de los ensayos de la secuencia proviral de VIH-1 integrales existentes, hemos desarrollado el Full –Length yoindividual Proviral Sequencing (FLIPS) ensayo. FLIPS es una secuenciación de próxima generación (NGS)-ensayo basado que amplifica y secuencias cerca de larga duración (intactas o defectuosos) de provirus VIH-1 de una manera eficiente y de alto rendimiento. FLIPS proporciona ventajas sobre el análisis anteriores, ya que limita el número de iniciadores utilizados; por lo tanto, disminuye la probabilidad de la cartilla desajustes, que pueden limitar la población de provirus capturaron o defectos sin querer introducen una secuencia viral. FLIPS también menos técnicamente es difícil que los anteriores y consiste en 6 pasos principales: células de lisis 1), de infectados por VIH-1, 2) la amplificación de solo provirus VIH-1 por PCR anidada realizada en limitación de dilución utilizando primers específicos para el altamente conservado HIV-1 5′ y la región 3′ LTR U5 (figura 1A), 3) purificación y cuantificación de productos amplificados, 4) preparación de la biblioteca de provirus amplificados para NGS, 5) NGS y 6) Asamblea de novo de provirus secuenciados para obtener contigs de cada uno los provirus.
Secuencias generadas por tirones pueden someterse a un riguroso proceso de eliminación para identificar a los que son genéticamente intacto y potencialmente réplica-competente (figura 1)2. Provirus intactos genéticamente carecen de todos los defectos conocidos que resultan en la generación de un provirus replicación incompetente. Estos defectos incluyen: secuencias de la inversión, canceladuras internas grandes, codones de parada hypermutation/deletéreos, mutágeno ‘ frameshift ‘ o mutaciones en el 5’ empaquetado mayor o señal empalme sitio dispensador de aceite (MSD).
Figura 1: pasos críticos en el análisis de la secuencia proviral individuales completos (FLIPS). (A) genoma de ADN de VIH-1 con sitios de unión de cartilla en 5′ y 3′ regiones U5 litros utilizados por tirones para amplificar cerca de larga duración (defectuosas e intactos) VIH-1 provirus por PCR anidada. (B) diseño de una placa PCR de 96 pocillos que contienen 80 pozos de muestra (20 pozos para cada dilución), 4 pozos de control negativo y control positivo 1 bien. (C) proceso de eliminación para identificar genéticamente intactos y potencialmente réplica-competente, provirus VIH-1. Esta figura ha sido modificada desde Hiener et al. 2 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El ensayo de VOLTERETAS es un método eficiente y de alto rendimiento para la amplificación y secuenciación individuales, cerca de larga duración provirus VIH-1. Se han identificado múltiples factores y pasos críticos en el protocolo que influyen en la cantidad y calidad de las secuencias obtenidas. En primer lugar, el número de células y la frecuencia de infección de VIH-1 de la población de células influyen en el número de provirus amplificado. Por ejemplo, en una publicación anterior, aproximadamente la mitad como muchas secuencias se obtuvieron el mismo número de ingenuo CD4+ T las células en comparación con memoria efectoras CD4+ T las células. Esto es porque las células ingenuas suelen tienen una menor frecuencia de infección de las células de memoria efectora2. En segundo lugar, la lisis celular es preferible a métodos basados en la columna de extracción para la obtención de ADN genómico como no hay riesgo de perder el ADN en el proceso de extracción. Por último, como con cualquier análisis de la polimerización en cadena-basado, prevención de la contaminación es crítico. Separadas las áreas limpias deben ser designadas para la preparación de mezclas principales, manejo de ADN genómico, agregar controles positivos, purificación de DNA y cuantificación y preparación de la biblioteca. Esto es particularmente importante para los ensayos de solo copia como la que aquí se presenta.
Aplicación de la prueba de saltos debe incluir primero ejecuta un control positivo como plásmidos pNL4-3 en lugar de las muestras participantes. Esto permitirá que cualquier solución de problemas antes de la utilización de las células positivas VIH-1, como se pueden comparar las secuencias obtenidas con secuencias de referencia disponibles para estos plásmidos. Cuando se utilizan las células positivas VIH-1, es importante considerar el subtipo VIH-1 (cartillas diseñadas para FLIPS son específicos de subtipo B) y la frecuencia de infección de la población de células si poco no provirus se amplifica. Secuencias de la cartilla pueden ser modificado/rediseñado para que coincida con otros subtipos. Además, un bien que contiene un control positivo se debe incluir en cada PCR realizada.
VOLTERETAS ha superado las limitaciones del anterior análisis de la secuencia, incluyendo SPS. A través de la amplificación y secuenciación cerca de provirus VIH-1 integrales, tirones pueden determinar la potencial competencia de replicación del provirus VIH-1. Esto no fue posible utilizar SPS, que ordenados sólo las regiones sub-genómica y por lo tanto seleccionada para secuencias con sitios de unión del primer intacto. Además, FLIPS supera las limitaciones asociadas con la utilización de múltiples amplificación y secuenciación cartillas, como fue contratado por la anterior secuencia largos ensayos1,4. A través de dos rondas de PCR dirigidas a las regiones LTR de HIV-1 combinadas con NGS, FLIPS disminuye el número y la complejidad de los primers requeridos. TIRONES por lo tanto es menos susceptible a las consecuencias de los desajustes de la cartilla, es decir, la identificación errónea de provirus defectuosos y una incapacidad para amplificar algunos provirus dentro de una población. El protocolo de FLIPS también es más eficiente y permite una mayor transferencia de secuencia que los métodos anteriores.
Evidentemente, FLIPS ofrece ventajas sobre los métodos existentes que determinan la composición genética del provirus VIH-1. Sin embargo, es importante reconocer las limitaciones de tirones. En primer lugar, el ensayo de tirones no se ha desarrollado como una herramienta para medir el tamaño de la reserva latente de VIH-1, como no se han completado los análisis para determinar si los tirones amplifica cada provirus VIH-1 en una población celular. TIRONES en cambio es útil para hacer comparaciones relativas de la composición del embalse entre las poblaciones de células diferentes2. En segundo lugar, la capacidad de replicación de intactas provirus VIH-1 no se puede determinar con certeza sin análisis en vivo , como los realizados por Ho et al. 4. en tercer lugar, tirones no está diseñado para determinar el sitio de integración del provirus VIH-1.
Pequeñas variaciones en el protocolo de tirones pueden aumentar su aplicación. Por ejemplo, cambios en la cartilla secuencias pueden permitir diferentes y múltiples subtipos de VIH-1 amplificado y secuenciado. La secuencia de viriones de VIH-1 de plasma es posible mediante la adición de la síntesis de cDNA antes de la polimerización en cadena jerarquizada. Futura utilización de métodos de secuenciación de molécula única eliminará la necesidad para el montaje de novo .
Secuenciación genética de integrado provirus VIH-1 ha aumentado nuestra comprensión de la reserva latente de VIH-1. FLIPS es una herramienta importante para futuros estudios elucidar la composición y distribución del reservorio latente. Sin embargo, la aplicación de tirones puede extenderse más allá del depósito. Los estudios futuros pueden utilizar FLIPS para determinar objetivos particulares para tecnología CRISPR-Cas, o ayudar en la identificación de la codificación y las regiones no codificantes que hacen más sensible a la latencia de agentes de inversión el virus. Recombinación viral puede entenderse mejor observando los sitios de cruce de grandes deleciones internas.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado el Delaney SIDA investigación empresa (DARE) para encontrar una cura (1U19AI096109 y 1UM1AI126611-01); un amfAR Consorcio de investigación sobre la erradicación del VIH (ARCHE) Collaborative Research Grant de la Fundación para la investigación del SIDA (amfAR 108074-50-RGRL); Centro Australiano para el VIH y Hepatitis investigación de Virología (ACH2); UCSF-GIVI centro para investigación del SIDA (P30 AI027763); y el nacional australiano de salud y Consejo de investigación médica (AAP1061681). Nos gustaría agradecer a Dr. Joey Lai, Gerente de centro de genómica en el Instituto de Westmead para la investigación médica para su entrenamiento en la preparación de la biblioteca y el uso de sus instalaciones y el centro de Ramaciotti genómica (Universidad de New South Wales, Sydney, Australia) para la realización de la secuencia. Reconocemos con gratitud los participantes quienes donaron muestras para este estudio.
UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0 | Invitrogen | 15568025 | Dilute to 5 mM for nested PCR |
Nonidet P 40 Substitute solution | Sigma | 98379 | |
Tween-20 | Sigma | P9416 | |
Proteinase K Solution (20 mg/mL) | Promega | AM2548 | |
96 well thermocycler | Any 96 well thermocycler can be used | ||
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
10X High Fidelity Buffer [600 mM Tris-SO4 (pH 8.9), 180 mM (NH4)2SO4] | Invitrogen | 11304011 | |
50 mM MgSO4 | Invitrogen | 11304011 | |
PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | C1141 | |
Ultrapure H2O | Invitrogen | 10977023 | |
PCR1 and PCR2 Primers | Desalted. Dilute to (100 M) with H2O | ||
PCR Plate 96 Well, Half Skirt, Single Notch Corner, Clear | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
Microseal 'B' Adhesive Seals | BioRad | MSB1001 | Required to seal 96 well PCR plates |
HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) | The following reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) from Dr. Malcolm Martin (Cat# 114). | Diluted to 10^5 copies/mL and used as positive control | |
PCR plate spinner or benchtop centrifuge | |||
E-GEL 48 1% Agarose | Invitrogen | G800801 | Precast 1% agarose gels (two gels used per 96 well plate). Any 1% agarose gel can be substituted. Contains ethidium bromide. |
DirectLoad Wide Range DNA Marker | Sigma | D7058 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
Mother E-Base device | Invitrogen | EBM03 | Required for running precast 48 well 1% agarose gels |
Gel Doc EZ Gel Documentation System | BioRad | 1708270 | Any visualisation system for ethidium bromide containing agarose gels can be used |
PlateMax Peelable Heat Sealing | Axygen | HS-200 | Heat sealing film for long term storage |
96 Well 0.8 mL Storage Plate | ThermoFisher Scientific | AB0765 | 0.8 mL 96 well plate required for magnetic bead based PCR purification |
Agencourt AMPure XP (PCR purification kit) | Beckman Coulter | A63880 | Magnetic bead based PCR purification kit. Other PCR purification kits can be substitued here (e.g. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Cat#28106) |
Ethyl alcohol, Pure. 200 proof, for molecular biology | Sigma | E7023 | |
Magnetic Stand-96 | Invitrogen | AM10027 | |
Microplate shaker | Optional | ||
Buffer EB | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P11496 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
Microplate reader | |||
Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-2001 | |
Hard-Shell 96-Well PCR Plates | Biorad | HSP9601 | Required for Nextera XT DNA library preparation kit |
Library Quantification Kit – Illumina/Universal | Kapa Biosystems | KK4824 | Other library quantification kits can be substitued (e.g. JetSeq DNA Library Quantification Lo-Rox Kit (Bioline Cat#BIO-68029) |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technology | Automated electrophoresis system . Use in conjunction with a High Sensistivity DNA kit | |
High Sensistivty DNA kit | Agilent Technology | 5067-4626 | |
Illumina MiSeq Platform | Illumina |