Estudio incorporación de ribonucleótido: Filamento específicos detección de ribonucleótidos en el genoma de levadura medir mutagénesis inducida por la ribonucleótido
Summary
Ribonucleótidos están entre los nucleótidos no canónico más abundantes incorporados en el genoma durante la replicación del ADN nuclear eucariótica. Si no quitado, ribonucleótidos pueden causar mutagénesis y daño de la DNA. Presentamos dos enfoques experimentales que se utilizan para evaluar la abundancia de incorporación ribonucleótido en ADN y sus efectos mutagénicos.
Abstract
La presencia de ribonucleótidos en el ADN nuclear ha demostrado ser una fuente de inestabilidad genómica. El grado de incorporación de ribonucleótido puede evaluarse por hidrólisis alcalina y electrophoresis del gel del RNA es muy susceptible a hidrólisis en condiciones alcalinas. Esto, en combinación con el análisis de Southern blot puede utilizarse para determinar la ubicación y el filamento en la que se han incorporado los ribonucleótidos. Sin embargo, este procedimiento es solamente semicuantitativa y puede no ser lo suficientemente sensible para detectar pequeños cambios en el contenido de ribonucleótido, aunque específicos de filamento Southern blot sondeo mejora la sensibilidad. Como una medida de una de las más sorprendentes consecuencias biológicas de ribonucleótidos en el ADN, mutagénesis espontánea pueden ser analizada utilizando un ensayo de mutación adelante. Mediante genes reporteros apropiados, mutaciones raras que resulta en la pérdida de función pueden ser seleccionada y en general y las tasas de mutación específica pueden medirse mediante la combinación de datos de experimentos de fluctuación con secuencia de la DNA del gene del reportero. El ensayo de fluctuación es aplicable para examinar una gran variedad de procesos mutagénicos en fondo genético específico o condiciones de crecimiento.
Introduction
Durante la replicación del ADN nuclear eucariótica, ribonucleótidos se incorporan en el genoma por todos tres principales replicases de ADN, ADN polimerasas (Pols) α, ε y δ1,2. Reparación de la supresión de Rnasa dependiente de H2 ribonucleótido (RER3) elimina la mayoría de estos ribonucleótidos incrustados.
Un ribonucleótido en el ADN es susceptible a la hidrólisis, como el grupo hidroxilo 2′ de la molécula de azúcar puede atacar el enlace fosfodiéster adyacente, liberando un extremo con un 2′ – 3′ fosfato cíclico y el otro con un 5′-OH4. Condiciones alcalinas pueden acelerar significativamente esta reacción. Así, la hidrólisis de los ribonucleótidos encajados durante la incubación en una solución básica causa fragmentación de la DNA genomic, que puede ser visualizada por electroforesis de agarosa alcalina5. Este ADN puede ser transferido a una membrana y sondeado por análisis de Southern blot usando sondas específicas de filamento que permiten la identificación de sitios sensibles al álcali causada por ribonucleótidos incorporados en el naciente líder – o -filamento del revestimiento termoaislante ADN, respectivamente.
En las células de levadura que carece actividad Rnasa H2, eliminación de ribonucleótidos se puede iniciar cuando topoisomerasa I (Top1) mellas el ADN en el ribonucleótido encajado6,7. Sin embargo, cuando se segmenta el Top1 del lado 3′ de la ribonucleótido, esto genera OH 5′ y 2′ – 3′ fosfato cíclico ADN extremos que son refractarios a la religación. La falta de reparación o procesamiento aberrante de estas ‘tapas sucias’ puede conducir a inestabilidad genómica. Además, si la incisión se produce dentro de una secuencia de ADN repetida, el proceso de reparación puede llevar a mutaciones de la canceladura. Esto es particularmente problemático para repeticiones en tándem, donde corto las canceladuras (de entre dos y cinco pares de bases) se observa comúnmente en las células deficientes de H2 de Rnasa. Los efectos deletéreos de Top1-dependiente en la ausencia de levadura Rnasa H2 actividad se exacerban en un mutante ε de polimerasa de la DNA (M644G pol2) promiscuo para incorporación de ribonucleótido durante el naciente líder síntesis de strand.
Procesamiento de ribonucleótidos en el ADN conduce a mutaciones espontáneas y este mutagénesis puede detectarse utilizando genes del reportero apropiada y seleccionando el cambio fenotípico que lo acompaña. Una prueba de fluctuación o experimento de Luria y Delbrück es uno de los métodos más utilizados para medir las tasas de mutación espontánea utilizando seleccionable reporter genes8,9. En la levadura, los genes URA3 y CAN1 pueden utilizarse como reporteros en un ensayo de mutación adelante, que permite la detección de todos los tipos de mutación que resultan en la pérdida de función del gene. La tasa de mutación espontánea es estimada como la media de lo observado para múltiples culturas paralelas de colonias individuales sin mutaciones en el gene del reportero de destino. Una levadura Rnasa H2-deficiente tensión tales como rnh201Δ tiene una tasa de mutación espontánea en general moderadamente elevada en gran parte causado por una elevada incidencia de deleciones de bp 2-5 en tándem de secuencias repetidas. Así, para caracterizar completamente los efectos mutagénicos de ribonucleótidos en el genoma, las tasas de mutación específica tiene que determinarse. En este caso, los genes del reportero URA3 o CAN1 pueden ser amplificados y secuenciados para determinar los tipos y localizaciones de las mutaciones, y pueden calcularse tasas de mutación específica. Compilación de mutaciones identificadas en varios mutantes URA3 o CAN1 independiente puede utilizarse entonces para generar un espectro de mutación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, describimos a los protocolos de dos series de experimentos que se utilizan con frecuencia para analizar cuantitativamente los ribonucleótidos incorporados durante la replicación del ADN y los efectos mutagénicos de ribonucleótidos rupturas. Aunque estos enfoques involucran el eukaryote modelo S. cerevisiae, estas técnicas se pueden adaptar fácilmente a otros microbios y eucariotas superiores incluso.
Sondeo de ribonucleótidos rupturas en el ADN mediante electroforesis en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los actuales y ex miembros del laboratorio de Kunkel por su trabajo y discusiones relacionadas con protocolo y reutilizar los datos presentados aquí. Este trabajo fue apoyado por proyecto Z01 ES065070 a T.A.K. de la división de investigación intramuros de los institutos nacionales de salud (NIH), nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental (NIEHS).
Materials
| YPD media | 20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H2O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave. | ||
| COM plates | 1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H2O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 – 35 ml per plate. | ||
| CAN plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 56 °C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution. | ||
| 5-FOA plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 60 °C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution. | ||
| L-Canavanine sulfate | US Biological | C1050 | |
| 5-FOA | US Biological | F5050 | |
| 20 mL glass culture tube | Any brand | ||
| Culture rotator in 30 °C incubator | Shaker incubator can be used instead | ||
| 96 well round bottom plates | Sterile, any brand | ||
| 3 mm glass beads | Fisher Scientific | 11-312A | Autoclave before use |
| 12-channel pipettes | Any brand | ||
| Ex Taq DNA Polymerase | TaKaRa | RR001 | |
| Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit | Epicenter | MPY80200 | |
| 3 M sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| 100% ethanol | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | Newer model available |
| dsDNA BR Assay kit | Invitrogen | Q32850 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Ficoll 400 | Dot Scientific Inc. | DSF10400 | |
| Bromocresol green | Eastman | 6356 | |
| Xylene cyanol FF | International Technologies Inc. | 72120 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 1 M Tris-HCl (pH 8.0) | Teknova | T5080 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | |
| UV transilluminator | |||
| Amersham Nylon membrane Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN303B | |
| 3 MM CHR Chromotography paper | Whatman | 3030-392 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| G-25 spin column | GE Healthcare | 27-5325-01 | |
| 1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2) | Sigma-Aldrich | NaH2PO4 (S9638); Na2HPO4 (S9390) |
|
| SDS | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671 | |
| Geiger counter |
References
- Joyce, C. M. Choosing the right sugar: how polymerases select a nucleotide substrate. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 94 (5), 1619-1622 (1997).
- Nick McElhinny, S. A., et al. Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (11), 4949-4954 (2010).
- Sparks, J. L., et al. RNase H2-initiated ribonucleotide excision repair. Molecular Cell. 47 (6), 980-986 (2012).
- Li, Y., Breaker, R. R. Kinetics of RNA Degradation by Specific Base Catalysis of Transesterification Involving the 2′-Hydroxyl Group. Journal of the American Chemical Society. 121 (23), 5364-5372 (1999).
- Nick McElhinny, S. A., et al. Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA. Nature Chemical Biology. 6 (10), 774-781 (2010).
- Williams, J. S., Kunkel, T. A. Ribonucleotides in DNA: origins, repair and consequences. DNA Repair (Amst). 19, 27-37 (2014).
- Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (6), 350-363 (2016).
- Jones, M. E., Thomas, S. M., Rogers, A. Luria-Delbruck fluctuation experiments: design and analysis. Genetics. 136 (3), 1209-1216 (1994).
- Zheng, Q. A new practical guide to the Luria-Delbruck protocol. Mutat Research. 781, 7-13 (2015).
- Sambrook, J. . Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , (2001).
- Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. The major roles of DNA polymerases epsilon and delta at the eukaryotic replication fork are evolutionarily conserved. PLoS Genetics. 7 (12), e1002407 (2011).
- Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. Ribonucleotides are signals for mismatch repair of leading-strand replication errors. Molecular Cell. 50 (3), 437-443 (2013).
- Williams, J. S., et al. Topoisomerase 1-mediated removal of ribonucleotides from nascent leading-strand DNA. Molecular Cell. 49 (5), 1010-1015 (2013).
- Clausen, A. R., et al. Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 185-191 (2015).
- Foster, P. L. Methods for determining spontaneous mutation rates. Methods Enzymology. 409, 195-213 (2006).
- Williams, J. S., et al. Evidence that processing of ribonucleotides in DNA by topoisomerase 1 is leading-strand specific. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (4), 291-297 (2015).
- Pavlov, Y. I., Shcherbakova, P. V., Kunkel, T. A. In vivo consequences of putative active site mutations in yeast DNA polymerases alpha, epsilon, delta, and zeta. Genetics. 159 (1), 47-64 (2001).
- Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).
- Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon. DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).
- Lujan, S. A., et al. Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity. PLoS Genetics. 8 (10), e1003016 (2012).
- Reijns, M. A., et al. Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development. Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).
- Lujan, S. A., et al. Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition. Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).
