Studium Ribonukleotidreduktase Aufnahme: Strang-spezifischen Nachweis von Purine Hefegenoms und Messen Ribonukleotidreduktase induzierter Mutagenese
Summary
Purine gehören zu den am häufigsten vorkommenden nicht-kanonischen Nukleotiden während Eukaryotische nukleare DNA-Replikation in das Genom integriert. Wenn nicht richtig entfernt, verursachen Purine DNA-Schäden und Mutagenese. Hier präsentieren wir Ihnen zwei experimentelle Ansätze, die verwendet werden, um die Fülle der Ribonukleotidreduktase Einbindung in DNA und seine mutagenen Wirkungen zu beurteilen.
Abstract
Das Vorhandensein der Purine in Kern-DNA hat sich gezeigt, eine Quelle der genomischen Instabilität sein. Das Ausmaß der Ribonukleotidreduktase Aufnahme beurteilt werden kann, durch alkalische Hydrolyse und gel-Elektrophorese als RNA Hydrolyse in alkalischen Bedingungen sehr anfällig ist. Dies, in Kombination mit südlicher Fleckanalyse lässt sich bestimmen Sie den Speicherort und Litze in die der Purine aufgenommen wurden. Aber dieses Verfahren ist nur semi-quantitativen und möglicherweise nicht empfindlich genug, um kleine Änderungen in Ribonukleotidreduktase Inhalte zu erkennen, obwohl das Strang-spezifische Südlicher Fleck sondieren die Empfindlichkeit verbessert. Als Maß für eines der auffälligsten biologischen Folgen der Purine in DNA kann spontane Mutagenese mit einem vorwärts Mutation Assay analysiert werden. Mit entsprechenden Reporter-Gene, können seltene Mutationen, die den Verlust der Funktion ausgewählt und allgemeine und spezifische Mutationsraten gemessen werden, indem Daten aus Fluktuation Experimente mit DNA-Sequenzierung des reportergens. Die Fluktuation-Assay ist für eine Vielzahl von mutagenen Prozessen in spezifischen genetischen Hintergrund oder Wachstumsbedingungen zu untersuchen.
Introduction
Während der eukaryotischen nukleare DNA-Replikation fließen Purine in das Genom von allen drei großen DNA Replicases, DNA-Polymerasen (Pols) α, ε und δ1,2. RNase H2-abhängige Ribonukleotidreduktase Exzision Reparatur (RER3) wird den Großteil dieser eingebetteten Purine entfernt.
Ribonukleotidreduktase in DNA ist anfällig gegenüber Hydrolyse, 2′-Hydroxylgruppe des Zucker-Verbindungsgruppe die angrenzenden Phosphodiester-Anleihe, Freigabe von einem Ende mit einer zyklischen Phosphat 2′ – 3′ und das andere mit einer 5′-OH-4angreifen kann. Alkalische Bedingungen können diese Reaktion erheblich beschleunigt. So verursacht die Hydrolyse von eingebetteten Purine während der Inkubation in eine Basislösung Fragmentierung der genomischen DNA, die durch alkalische Agarose Elektrophorese5visualisiert werden kann. Diese DNA kann auf eine Membran übertragen und sondiert durch südlicher Fleckanalyse mit Strang-spezifischen Sonden, die es die Identifizierung von alkaliempfindlichen Websites durch Purine aufgenommen in der im Entstehen begriffenen führenden ermöglichen- oder -Verzögerungsstrang DNA verursacht, bzw..
In Hefezellen RNase H2 Aktivität fehlt kann Abbau der Purine eingeleitet werden, wenn Topoisomerase ich (Top1) die DNA im eingebetteten Ribonukleotidreduktase6,7 Nicks. Jedoch wenn Top1 auf 3′ der die Ribonukleotidreduktase zerspaltet, generiert das 5′-OH und 2′ – 3′ zyklischen Phosphat DNA-enden, die refraktär gegenüber Religation sind. Reparatur oder abweichende Verarbeitung diese’schmutzigen ‘enden können, genomische Instabilität führen. Darüber hinaus tritt der Schnitt innerhalb von einer wiederholte DNA-Sequenz, kann die Reparatur-Prozess zu Löschung Mutationen führen. Dies ist besonders problematisch für Tandem wiederholt, wo kurze Deletionen (von zwischen zwei und fünf Basenpaaren) sind häufig in RNase H2-defizienten Zellen beobachtet. Die Top1-abhängige schädlichen Wirkungen bei fehlender Hefe RNase H2 Aktivität werden in eine DNA-Polymerase ε Mutante (pol2-M644G) promiscuous Ribonukleotidreduktase Aufnahme während der im Entstehen begriffenen führenden Strang-Synthese verstärkt.
Verarbeitung der Purine in DNA führt zu spontanen Mutationen und diese Mutagenese kann durch die Verwendung geeigneter Reporter-Gene und Auswahl für die begleitenden phänotypische Veränderung erkannt werden. Eine Fluktuation Test oder Luria und Delbrück Experiment ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden, um spontane Mutation mit wählbaren Reporter Gene8,9messen. In Hefe können die URA3 und CAN1 Gene als Reporter in einem vorwärts Mutation Assay verwendet werden, ermöglicht die Erkennung aller Arten der Mutation, die zum Verlust der Genfunktion. Die spontane Mutationsrate dürfte als der Median, die für mehrere parallele Kulturen begann aus einzelnen Kolonien ohne Mutationen in das Zielgen Reporter beobachtet. Eine Hefe RNase H2-defizienten Stamm wie rnh201Δ hat einen leicht erhöhten insgesamt spontane Mutationsrate, die weitgehend von einer erhöhten Inzidenz von 2-5 bp Löschungen im Tandem verursacht wird wiederholen Sequenzen. Also, um die mutagenen Wirkungen der Purine im Genom vollständig zu charakterisieren, spezifische Mutationsraten müssen ermittelt werden. In diesem Fall URA3 oder CAN1 Reporter-Gene können verstärkt und sequenziert, um festzustellen, die Typen und Standorte der Mutationen, und spezifische Mutationsraten errechnet werden. Kompilieren von Mutationen identifiziert in mehrere unabhängige URA3 oder CAN1 Mutanten kann dann verwendet werden, um eine Mutation-Spektrum zu erzeugen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir die Protokolle für zwei Sätze von Experimenten, die häufig verwendet werden, um Purine aufgenommen während der DNA-Replikation und die mutagene Wirkung von unrepariert Purine Semi-quantitativ zu analysieren. Obwohl diese Ansätze die Modell Eukaryote S. Cerevisiaebeinhalten, können diese Techniken leicht zu anderen Mikroben und noch höheren Eukaryoten angepasst werden.
Sondierung für unrepariert Purine in DNA mit Hilfe von alkalischen Agarose Elektrophorese…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bedanken uns bei allen aktuelle und ehemalige Kunkel Lab Mitgliedern für ihre Arbeit und Diskussionen im Zusammenhang mit Protokoll und die hier vorgestellte Daten wiederverwendet. Diese Arbeit wurde von Projekt-Z01-ES065070, T.A.K. aus der Division des intramuralen Forschung von den National Institutes of Health (NIH), National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) unterstützt.
Materials
| YPD media | 20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H2O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave. | ||
| COM plates | 1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H2O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 – 35 ml per plate. | ||
| CAN plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 56 °C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution. | ||
| 5-FOA plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 60 °C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution. | ||
| L-Canavanine sulfate | US Biological | C1050 | |
| 5-FOA | US Biological | F5050 | |
| 20 mL glass culture tube | Any brand | ||
| Culture rotator in 30 °C incubator | Shaker incubator can be used instead | ||
| 96 well round bottom plates | Sterile, any brand | ||
| 3 mm glass beads | Fisher Scientific | 11-312A | Autoclave before use |
| 12-channel pipettes | Any brand | ||
| Ex Taq DNA Polymerase | TaKaRa | RR001 | |
| Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit | Epicenter | MPY80200 | |
| 3 M sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| 100% ethanol | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | Newer model available |
| dsDNA BR Assay kit | Invitrogen | Q32850 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Ficoll 400 | Dot Scientific Inc. | DSF10400 | |
| Bromocresol green | Eastman | 6356 | |
| Xylene cyanol FF | International Technologies Inc. | 72120 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 1 M Tris-HCl (pH 8.0) | Teknova | T5080 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | |
| UV transilluminator | |||
| Amersham Nylon membrane Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN303B | |
| 3 MM CHR Chromotography paper | Whatman | 3030-392 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| G-25 spin column | GE Healthcare | 27-5325-01 | |
| 1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2) | Sigma-Aldrich | NaH2PO4 (S9638); Na2HPO4 (S9390) |
|
| SDS | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671 | |
| Geiger counter |
References
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