Studere Ribonucleotide inkorporering: Strand-spesifikke påvisning av Ribonucleotides i gjær genomet og måler Ribonucleotide-indusert mutagenese
Summary
Ribonucleotides er blant de rikeste ikke-kanoniske nukleotider innlemmet i genomet eukaryote kjernefysiske utryddelse. Hvis ikke riktig fjernet, kan det forårsake ribonucleotides DNA skade og mutagenese. Her presenterer vi to eksperimentell tilnærminger som brukes til å vurdere overflod av ribonucleotide inkorporering DNA og dens mutagene effekter.
Abstract
Tilstedeværelsen av ribonucleotides i kjernefysiske DNA har vist seg å være en kilde til genomisk ustabilitet. Omfanget av ribonucleotide innlemmelse kan bli vurdert av alkalisk hydrolyse og gel geleelektroforese RNA er svært utsatt for hydrolyse i alkaliske forhold. Dette, kan sammen med sørlige blot analyse brukes til å bestemme plasseringen og strand inn som ribonucleotides er innarbeidet. Men denne prosedyren er bare semi kvantitative og kan ikke være sensitive nok til å oppdage små endringer i ribonucleotide innhold, men strand-spesifikke sørlige blot sondering forbedrer sensitiviteten. Som et mål på en av de mest slående biologiske konsekvensene av ribonucleotides i DNA, kan spontan mutagenese analyseres ved hjelp av en frem mutasjon analysen. Bruker riktig reporter gener, sjeldne mutasjoner som resulterer i tap av funksjon kan være valgt og generelle og spesifikke mutasjonen priser kan måles ved å kombinere data fra svingninger eksperimenter med DNA sekvensering av reporteren genet. Svingninger analysen gjelder undersøke en rekke mutagene prosesser i bestemt genetisk bakgrunn eller betingelser for vekst.
Introduction
Eukaryote kjernefysiske utryddelse, er ribonucleotides innlemmet i genomet av alle tre store DNA replicases, DNA polymerases (Pols) α, ε og ses1,2. RNase H2-avhengige ribonucleotide excision reparasjon (RER3) fjerner fleste av disse innebygde ribonucleotides.
En ribonucleotide i DNA er utsatt for hydrolyse, som 2 hydroksyl gruppen av sukker moiety kan angripe den tilstøtende phosphodiester bond, slippe en ende med en 2 – 3′ syklisk fosfat og den andre med en 5′-OH4. Alkaliske forhold kan sterkt akselerere denne reaksjonen. Dermed fører hydrolyse av innebygde ribonucleotides under inkubasjonen i en grunnleggende løsning fragmentering av genomisk DNA, som kan visualiseres alkaliske-agarose geleelektroforese5. Denne DNA kan overføres til en membran og analysert av sørlige blot analyse ved hjelp av strand-spesifikke sonder at identifikasjon av lut-sensitive områder skyldes ribonucleotides innlemmet i den gryende ledende – eller henger-stranden DNA, henholdsvis.
I gjærceller mangler RNase H2 aktivitet, kan fjerning av ribonucleotides startes når topoisomerase jeg (Top1) kutt DNA på den innebygde ribonucleotide6,7. Men når Top1 kløyver på 3 side av ribonucleotide, genererer dette 5′-OH og 2 – 3′ syklisk fosfat DNA ender som er ildfaste til religation. Reparasjon eller avvikende behandling av disse skitne ender kan føre til genomisk ustabilitet. I tillegg hvis i snitt i en gjenta DNA sekvens, kan reparasjonsprosessen føre til sletting mutasjoner. Dette er spesielt problematisk for tandem gjentas, der korte slettinger (på mellom to og fem base parene) er ofte observert i RNase H2-mangelfull celler. Avhengig av Top1 skadelige effektene i fravær av gjær RNase H2 aktivitet er forsterket en DNA polymerase ε mutant (pol2-M644G) promiskuøse for ribonucleotide innlemmelse i begynnende ledende strand syntese.
Behandling av ribonucleotides i DNA fører til spontane mutasjoner og denne mutagenese kan oppdages ved hjelp av riktig reporter gener og velger for tilhørende fenotypiske endringen. En svingninger test eller Luria og Delbrück eksperiment er en av de mest brukte metodene for å måle spontan mutasjon priser bruker valgbar reporter gener8,9. I gjær, kan URA3 og CAN1 gener brukes som journalister i en frem mutasjon analysen, som gir mulighet for gjenkjenning av alle mutasjon typer som resulterer i tap av gen funksjon. Spontan Mutasjonshastigheten er beregnet som medianen til som observert i flere parallelle kulturer startet fra enkelt kolonier uten mutasjoner i målet reporter genet. En gjær RNase H2-mangelfull belastning som rnh201Δ har en moderat opphøyet samlet spontan mutasjon rente som skyldes i stor grad en forhøyet forekomst av 2-5 bp slettinger i tandem gjenta sekvensene. Dermed fullt betegner mutagene effekten av ribonucleotides i genomet, må spesifikke mutasjonen priser bestemmes. I dette tilfellet URA3 eller CAN1 reporter genene kan forsterkes og rekkefølge for å fastslå hvilke typer og plassering av mutasjoner, og spesifikke mutasjonen priser kan beregnes. Kompilering mutasjoner i flere uavhengige URA3 eller CAN1 mutanter kan deretter brukes til å generere en mutasjon spektrum.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi protokollene for to sett av eksperimenter som ofte brukes til å analysere semi kvantitativt ribonucleotides innlemmet under utryddelse og mutagene effekten av ikke er reparert ribonucleotides. Selv om disse tilnærminger involvere modell eukaryoter S. cerevisiae, kan disse teknikkene lett tilpasses andre mikrober og enda høyere eukaryoter.
Leter etter ikke er reparert ribonucleotides i DNA bruker alkaliske-agarose geleelektroforese kombinert med Southern blotting gi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker alle nåværende og tidligere Kunkel Lab medlemmer for deres arbeid og diskusjoner relatert til protokollen og gjenbrukes dataene som presenteres her. Dette arbeidet ble støttet av prosjektet Z01 ES065070 til T.A.K. fra delingen av Intramural forskning av National Institutes of Health (NIH), National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS).
Materials
| YPD media | 20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H2O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave. | ||
| COM plates | 1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H2O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 – 35 ml per plate. | ||
| CAN plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 56 °C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution. | ||
| 5-FOA plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 60 °C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution. | ||
| L-Canavanine sulfate | US Biological | C1050 | |
| 5-FOA | US Biological | F5050 | |
| 20 mL glass culture tube | Any brand | ||
| Culture rotator in 30 °C incubator | Shaker incubator can be used instead | ||
| 96 well round bottom plates | Sterile, any brand | ||
| 3 mm glass beads | Fisher Scientific | 11-312A | Autoclave before use |
| 12-channel pipettes | Any brand | ||
| Ex Taq DNA Polymerase | TaKaRa | RR001 | |
| Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit | Epicenter | MPY80200 | |
| 3 M sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| 100% ethanol | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | Newer model available |
| dsDNA BR Assay kit | Invitrogen | Q32850 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Ficoll 400 | Dot Scientific Inc. | DSF10400 | |
| Bromocresol green | Eastman | 6356 | |
| Xylene cyanol FF | International Technologies Inc. | 72120 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 1 M Tris-HCl (pH 8.0) | Teknova | T5080 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | |
| UV transilluminator | |||
| Amersham Nylon membrane Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN303B | |
| 3 MM CHR Chromotography paper | Whatman | 3030-392 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| G-25 spin column | GE Healthcare | 27-5325-01 | |
| 1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2) | Sigma-Aldrich | NaH2PO4 (S9638); Na2HPO4 (S9390) |
|
| SDS | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671 | |
| Geiger counter |
References
- Joyce, C. M. Choosing the right sugar: how polymerases select a nucleotide substrate. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 94 (5), 1619-1622 (1997).
- Nick McElhinny, S. A., et al. Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (11), 4949-4954 (2010).
- Sparks, J. L., et al. RNase H2-initiated ribonucleotide excision repair. Molecular Cell. 47 (6), 980-986 (2012).
- Li, Y., Breaker, R. R. Kinetics of RNA Degradation by Specific Base Catalysis of Transesterification Involving the 2′-Hydroxyl Group. Journal of the American Chemical Society. 121 (23), 5364-5372 (1999).
- Nick McElhinny, S. A., et al. Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA. Nature Chemical Biology. 6 (10), 774-781 (2010).
- Williams, J. S., Kunkel, T. A. Ribonucleotides in DNA: origins, repair and consequences. DNA Repair (Amst). 19, 27-37 (2014).
- Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (6), 350-363 (2016).
- Jones, M. E., Thomas, S. M., Rogers, A. Luria-Delbruck fluctuation experiments: design and analysis. Genetics. 136 (3), 1209-1216 (1994).
- Zheng, Q. A new practical guide to the Luria-Delbruck protocol. Mutat Research. 781, 7-13 (2015).
- Sambrook, J. . Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , (2001).
- Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. The major roles of DNA polymerases epsilon and delta at the eukaryotic replication fork are evolutionarily conserved. PLoS Genetics. 7 (12), e1002407 (2011).
- Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. Ribonucleotides are signals for mismatch repair of leading-strand replication errors. Molecular Cell. 50 (3), 437-443 (2013).
- Williams, J. S., et al. Topoisomerase 1-mediated removal of ribonucleotides from nascent leading-strand DNA. Molecular Cell. 49 (5), 1010-1015 (2013).
- Clausen, A. R., et al. Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 185-191 (2015).
- Foster, P. L. Methods for determining spontaneous mutation rates. Methods Enzymology. 409, 195-213 (2006).
- Williams, J. S., et al. Evidence that processing of ribonucleotides in DNA by topoisomerase 1 is leading-strand specific. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (4), 291-297 (2015).
- Pavlov, Y. I., Shcherbakova, P. V., Kunkel, T. A. In vivo consequences of putative active site mutations in yeast DNA polymerases alpha, epsilon, delta, and zeta. Genetics. 159 (1), 47-64 (2001).
- Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).
- Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon. DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).
- Lujan, S. A., et al. Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity. PLoS Genetics. 8 (10), e1003016 (2012).
- Reijns, M. A., et al. Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development. Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).
- Lujan, S. A., et al. Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition. Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).
