השימוש העכבר Splenocytes כדי להעריך את ההשפעה הקשורים הפתוגן התבנית המולקולרית על ביטוי גנים שעון
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה באמצעות העכבר splenocytes לגלות דפוסי מולקולריים הקשורים הפתוגן שמשנות ביטוי גנים שעון מולקולרי.
Abstract
מהתנהגות על ביטוי גנים, השעון הביולוגי לווסת כמעט בכל ההיבטים של פיזיולוגיה. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה אתגר splenocytes עכבר עם ליפופוליסכריד פתוגן-הקשורים דפוסי מולקולרית (PAMPs) (LPS), ODN1826, חום-נהרג ליסטריה ולבחון את השפעתם על מולקולרית היממה שעון. בעבר, מחקרים התמקדו בחינת השפעתה של LPS על השעון המולקולרי באמצעות מגוון של גישות ויוו ו- ex-vivo מבחר דגמים (למשל, עכבר, חולדה, האדם). פרוטוקול זה מתאר את הבידוד ואת האתגר של splenocytes, כמו גם את המתודולוגיה כדי להעריך את השעון ג’ין ביטוי האתגר שלאחר באמצעות PCR כמותי. גישה זו ניתן להעריך לא רק את ההשפעה של רכיבים חיידקים על השעון המולקולרי אבל מולקולות אחרות כמו גם זה עשוי לשנות את הביטוי של השעון. גישה זו יכול להיות מנוצל כדי לקנטר לגזרים את המנגנון המולקולרי של כיצד משפיע על האינטראקציה קולטן PAMP-אגרה-כמו שעון הביטוי.
Introduction
שעון אב ביונקים, אשר האחראית תנודות 24 שעות ביממה עבור כמעט כל ההיבטים של פיזיולוגיה והתנהגות, הינו ממוקם במרחק העל-תצלובתי (SCN) של ההיפותלמוס1,2. בנוסף, ויסות תהליכים ביולוגיים ברמת organismal מסנכרנת שעון אב היקפיים שעונים הסלולר ברחבי הגוף3,4,5. בעוד המנגנון שעון מולקולרי מורכבת לפחות 3 לולאות משוב תעתיק translational שלובים, הליבה מורכבת של התקופה (Per1-3), קריפטוכרום (Cry1-2), Bmal1, ואת השעון גנים6,7. מלבד שמירה על התזמון מדויק של השעון המולקולרי הליבה, כמה מוצרים ג’ין שעון נלווים (למשל, Rev-erbα , Dbp) גם לווסת את הביטוי של גנים שאינם שעון, קרי, שעון מבוקר גנים (CCGs)6 , 7.
הפונקציונליים שעונים מולקולרית תוארו שונים ברקמות מערכת החיסון (למשל, הטחול ובלוטות הלימפה)8 , תאים (למשל, B תאים, תאים דנדריטים, מקרופאגים)8,9. תאים אלה לזהות ולהגיב פתוגן-הקשורים מולקולרית דפוסים (PAMPs), שנשמרת הרכיבים מיקרוביאלי, באמצעות קולטנים זיהוי מערכת החיסון מולדים כגון אגרה דמוי קולטנים (TLRs)10. עד כה, 13 TLRs תפקודית תוארו, אשר מזהה את המרכיבים חיידקים כגון רכיבי הקיר תא החיידק, השוטוניים חלבון מיקרוביאלי חומצות גרעין10. PAMP, ליפופוליסכריד (LPS), מרכיב דופן התא של חיידקים גראם שליליים מזוהה על-ידי TLR4, הוכח לשנות מקצבים השעון הביולוגי ברמות organismal והן מולקולרית. לדוגמה, ויוו האתגר של LPS מושרה עיכובים photic כמו שלב כפי שנמדד על-ידי פעילות עכברים11 והוביל לביטוי גנים שעון מופחת ב SCN ו הכבד כפי שנקבע על ידי הכלאה בחיי עיר ו- PCR כמותי, בהתאמה, בעוד עכברושים12. לאחר ויוו אתגר עם התקליטים, ניתוח של דם היקפיים אנושי לויקוציטים13 ו רקמת השומן התת עורית14 גילה ביטוי שונה של מספר גנים השעון כפי שנמדדה באמצעות qPCR. לבסוף, שמחוץ LPS באתגרים של מקרופאגים האנושי מקרופאגים הצפק העכבר, הוביל גם שינו שעון ביטוי כפי שהיא נמדדת qPCR14.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כדי להעריך את השפעת התקליטים PAMPs, ODN1826 (oligonucleotides סינטטי המכיל unmethylated מוטיבים CpG), וחום-נהרג ליסטריה (HKLM), מזוהה על-ידי TLR4, TLR9 ו- TLR2, בהתאמה, על שעון מולקולרי ביטוי גנים ב העכבר splenocytes. הפרוטוקול כולל העכבר ספלנקטומיה, בידוד splenocyte, אתגר, RNA החילוץ, סינתזה cDNA qPCR להעריך ביטוי של מספר גנים שעון. פרוטוקול זה מאפשר רכישת מספר גדול של תאים חיסוניים עם מעט מאוד חיים בזמן או מניפולציה הסלולר, אז מה שיכול להיות מאותגרת שמחוץ עם PAMPs שונים. השעון המולקולרי הוכח לווסת את ההיבטים השונים של ה8,15,של התגובה החיסונית16, לכן, שיבוש של השעון המולקולרי סביר לפגום את הווריאציה תלויי-זמן נאות של התגובה החיסונית. בנוסף, מאז שיבושים של השעון הביולוגי יכול להוביל מבעיות17,18,19,20, זה עשוי להיות עניין לחוקרים לאתגר את splenocytes עם מגוון רחב של מולקולות ולהעריך את השפעתם על השעון.
Protocol
Representative Results
Discussion
בתוך פרוטוקול זה, ספקטרופוטומטרים microvolume יכול לשמש כדי לכמת ולהעריך את טוהר הרנ א בשימוש בקביעת ביטוי גנים. חומצות גרעין לספוג אולטרא סגול-260 ננומטר, חלבונים בדרך כלל סופגים אור-280 ננומטר, ואילו אחרים מזהמים פוטנציאליים בשימוש במהלך שגרת החילוץ RNA (למשל, פנול) לזיהוי ב- 230 ננומטר. לכן, על-?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי סגל המחקר מעניק מתפקידה המכללה לאמנויות ודין מדעי באוניברסיטת הארטפורד.
Materials
| Frosted slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Cell strainers | Fisher | 22363547 | |
| Lipopolysaccharide | InvivoGen | ltrl-eklps | |
| ODN1826 | InvivoGen | Tlrl-1826-1 | |
| HKLM | InvivoGen | Tlrl-hklm | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| PBS | Gibco | 20012-043 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 or 74106 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| 6-well cell culture plate | Denville | T1006 | |
| 50 ml tubes | Corning | 352070 | |
| 15 ml tubes | Corning | 352097 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| TaqMan Gene Expression Assays b-actin | ThermoFisher | Mm00607939_s1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Per2 | ThermoFisher | Mm00478113_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba | ThermoFisher | Mm00520708_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Bmal1 | ThermoFisher | Mm00500226_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Dbp | ThermoFisher | Mm00497539_m1 | |
| qPCR machine StepOnePlus | ThermoFisher | ||
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher | 4369016 | |
| MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 ml) | ThermoFisher | 4346907 | |
| Statistical Analysis Software | Prism 7.0a |
References
- Bell-Pedersen, D., et al. Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms. Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).
- Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals. Annu. Rev. Neurosci. 35, 445-462 (2012).
- Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U. A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 93, 929-937 (1998).
- Yoo, S. -. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 5339-5346 (2004).
- Yamazaki, S. Resetting Central and Peripheral Circadian Oscillators in Transgenic Rats. Science. 288, 682-685 (2000).
- Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. Genetics of circadian rhythms in mammalian model organisms. Adv. Genet. 74, 175-230 (2011).
- Curtis, A. M., Bellet, M. M., Sassone-Corsi, P., O’Neill, L. A. J. Circadian Clock Proteins and Immunity. Immunity. 40, 178-186 (2014).
- Keller, M., et al. A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21407-21412 (2009).
- Silver, A. C., Arjona, A., Hughes, M. E., Nitabach, M. N., Fikrig, E. Circadian expression of clock genes in mouse macrophages, dendritic cells, and B cells. Brain. Behav. Immun. 26, 407-413 (2012).
- Kawai, T., Akira, S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity update on Toll-like receptors. Nat. Publ. Gr. 11, 373-384 (2010).
- Marpegán, L., Bekinschtein, T. A., Costas, M. A., Golombek, D. A. Circadian responses to endotoxin treatment in mice. J. Neuroimmunol. 160, 102-109 (2005).
- Okada, K., et al. Injection of LPS Causes Transient Suppression of Biological Clock Genes in Rats. J. Surg. Res. 145, 5-12 (2008).
- Haimovich, B., et al. In vivo endotoxin synchronizes and suppresses clock gene expression in human peripheral blood leukocytes. Crit. Care Med. 38, 751-758 (2010).
- Curtis, A. M., et al. Circadian control of innate immunity in macrophages by miR-155 targeting Bmal1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7231-7236 (2015).
- Silver, A. C., Arjona, A., Walker, W. E., Fikrig, E. The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity. Immunity. , (2012).
- Gibbs, J. E., et al. The nuclear receptor REV-ERB α mediates circadian regulation of innate immunity through selective regulation of inflammatory cytokines. PNAS. 109, 582-587 (2012).
- Zee, P. C., Attarian, H., Videnovic, A. Circadian rhythm abnormalities. Contin. Lifelong Learn. Neurol. 19, 132-147 (2013).
- Bovbjerg, D. H. Circadian disruption and cancer: sleep and immune regulation. Brain. Behav. Immun. 17, 48-50 (2003).
- Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat. Rev. Cancer. 3, 350-361 (2003).
- Germain, A., Kupfer, D. J. CIRCADIAN RHYTHM DISTURBANCES IN DEPRESSION. Hum. Psychopharmacol. 23, 571-585 (2008).
- . Basic Mouse Care and Maintenance. JoVE. , (2018).
- Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals : 2013 Edition. AVMA. , (2013).
- Silver, A. C. Pathogen-associated molecular patterns alter molecular clock gene expression in mouse splenocytes. PLoS One. , 12-15 (2017).
- Silver, A. C., et al. Daily oscillations in expression and responsiveness of Toll-like receptors in splenic immune cells. Heliyon. , 00579 (2018).
