कल्चरल न्यूरॉन्स में Synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग के लिए एक ऑप्टिकल परख Presynaptic प्रोटीन को व्यक्त
Summary
हम synaptic पुटिका (एसवी) के लिए एक ऑप्टिकल परख कल्चरल न्यूरॉन्स में रीसाइक्लिंग का वर्णन । डबल अभिकर्मक के साथ इस प्रोटोकॉल का मेल एक presynaptic मार्कर और ब्याज की प्रोटीन व्यक्त करने के लिए हमें presynaptic साइटों का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, उनके synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग क्षमता, और ब्याज की प्रोटीन की भूमिका निर्धारित करते हैं ।
Abstract
सक्रिय presynaptic तंत्रिका टर्मिनलों पर, synaptic बुलबुले exo के चक्र से गुजरना-और endocytosis । रीसाइक्लिंग के दौरान, एसवी transmembrane प्रोटीन के चमकीले डोमेन कोशिका की सतह पर खुल जाते हैं । इनमें से एक प्रोटीन Synaptotagmin-1 (Syt1) है । एक एंटीबॉडी Syt1 के चमकदार डोमेन के खिलाफ निर्देशित, एक बार संस्कृति माध्यम में जोड़ा, exo-endocytotic चक्र के दौरान लिया जाता है । इस quantified एसवी रीसाइक्लिंग की राशि के लिए आनुपातिक है और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के माध्यम से किया जा सकता है । यहां, हम Syt1 एंटीबॉडी के साथ गठबंधन हिप्पोकैम्पस ंयूरॉंस के डबल अभिकर्मक के साथ । यह हमें की अनुमति देता है (1) information presynaptic रिकॉमबिनेंट presynaptic मार्कर Synaptophysin की अभिव्यक्ति के आधार पर साइटों, (2) Syt1 का उपयोग करते हुए उनकी कार्यक्षमता का निर्धारण, और (3) लक्ष्यीकरण और ब्याज की एक प्रोटीन के प्रभाव की विशेषता, GFP-Rogdi.
Introduction
synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग का अध्ययन कैसे presynaptic गुण बदलने के निर्धारण में महत्वपूर्ण है, या तो synaptic प्लास्टिक के दौरान या गड़बड़ी समारोह के synaptic के जवाब में । Synaptotagmin-1 (Syt1) एंटीबॉडी का अध्ययन करना एसवी रीसाइक्लिंग की मात्रा को मापने का एक तरीका प्रदान करता है । Syt1 एक एसवी-एसोसिएटेड प्रोटीन है जो एक Ca2 + सेंसर के रूप में कार्य करता है और न्यूरोट्रांसमीटर1,2के exocytotic रिलीज के लिए आवश्यक है । यह एसवी के बाहर एक सी-टर्मिनल cytoplasmic डोमेन और एसवी3के अंदर एक एन-टर्मिनल चमकीले डोमेन के साथ एक transmembrane प्रोटीन है । exocytosis के दौरान Syt1 का चमकीला डोमेन बाहरी माध्यम के संपर्क में आ जाता है । इस बाहरी माध्यम के लिए, हम cytoplasmic डोमेन है, जो endocytosis के दौरान आंतरिक हो जाता है के खिलाफ निर्देश एंटीबॉडी जोड़ें । ये एंटीबॉडी या तो पूर्व माध्यमिक एंटीबॉडी4,5,6,7के साथ fluorophores या immunostained के साथ संयुग्मित हो सकता है । परिणामस्वरूप immunosignal की प्रतिदीप्ति तीव्रता एसवी रीसाइक्लिंग की राशि के लिए आनुपातिक है । यह दृष्टिकोण दोनों के लिए गठित और ध्रुवीकरण-प्रेरित एसवी6,8रिसाइकिलिंग निर्धारित किया जा सकता है ।
Syt1 को ऊपर उठाने की परख की जा सकती है वायरस मध्यस्थता जीन हस्तांतरण के बाद वस्तुतः पकवान में सभी कोशिकाओं या कोशिकाओं की एक छोटी संख्या के विरल अभिकर्मक के बाद । हमारे विधि प्राथमिक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के स्पार्स डबल अभिकर्मक कैल्शियम फॉस्फेट9का उपयोग कर के साथ परख को जोड़ती है. हम एक रिकॉमबिनेंट मार्कर के लिए presynapses पर जमा ज्ञात प्रोटीन का उपयोग करें, फ्लोरोसेंट टैग Synaptophysin, presynaptic टर्मिनलों का पता लगाने और ब्याज की हमारे प्रोटीन, Rogdi । यह हमें परीक्षण करने के लिए या नहीं Rogdi लक्ष्य कार्यात्मक synapses और एसवी रिसाइकिलिंग को प्रभावित करता है की अनुमति देता है । जीन एंकोडिंग Rogdi मूल रूप से Drosophila म्यूटेंट के लिए एक स्क्रीन में पहचान की थी बिगड़ा स्मृति10द्वारा विशेषता । मनुष्यों में, Rogdi जीन में उत्परिवर्तनों Kohlschütter-Tönz सिंड्रोम नामक एक दुर्लभ और विनाशकारी रोग का कारण । रोगियों दंत तामचीनी विकृतियों, pharmacoresistant मिर्गी, और मनोप्रेरणा देरी से पीड़ित; हालांकि, जीन उत्पाद का उपसेलुलर स्थानीयकरण11मायावी बना रहा । इस प्रकार, Syt1 कार्रवाई परख GFP के स्थानीयकरण के लिए महत्वपूर्ण सबूत-टैग Rogdi कार्यात्मक synapses9में प्रदान की है ।
इस तीनो तकनीक के कई फायदे हैं । सबसे पहले, एसवी पुनर्चक्रण दोनों वास्तविक समय में प्रदर्शन करके लाइव इमेजिंग7,12, और Syt1 प्रतिदीप्ति लेबल की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के द्वारा6,9 निर्धारण के बाद मनाया जा सकता है । साथ ही, कई Syt1 एंटीबॉडी वेरिएंट डेवलप किए गए हैं । वहां untagged वेरिएंट है कि एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ एक मानक immunostaining प्रोटोकॉल के बाद निर्धारण, और पहले से ही संलग्न एक प्रतिदीप्ति लेबल के साथ पूर्व संयुग्मित वेरिएंट के साथ लेबल किया जा सकता है । अंत में, एंटीबॉडी आधारित प्रतिदीप्ति व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माध्यमिक या संयुग्मित रंजक है कि इस्तेमाल किया जा सकता है की बड़ी चयन के कारण लाभप्रद है ।
जब फिक्सिंग और ंयूरॉंस immunostaining, यह भी संभव अतिरिक्त प्रोटीन के लिए दाग और colocalization विश्लेषण प्रदर्शन । यह निर्धारित करने में मदद कर सकते है जहां वे SVs रीसाइक्लिंग के संबंध में स्थित हैं । प्रतिदीप्ति लेबल की तीव्रता एसवी पुनर्चक्रण की मात्रा का सीधा उपाय है । इसके अलावा, एंटीबॉडी चुनिंदा लेबल Syt1 युक्त संरचनाओं, उच्च विशिष्टता और थोड़ा पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति4में जिसके परिणामस्वरूप । विभिंन उत्तेजना प्रोटोकॉल भी इस्तेमाल किया जा सकता है, ऐसे ध्रुवीकरण बफ़र या बिजली उत्तेजना प्रोटोकॉल9,12,13,14के रूप में । हालांकि, बेसल एसवी रीसाइक्लिंग के बिना मापा जा सकता है ंयूरॉन संस्कृतियों15उत्तेजक ।
हमारी विधि विशेष रूप से निर्धारण के बाद माध्यमिक एंटीबॉडी immunolabeling के साथ डबल-transfected न्यूरॉन्स में Syt1 एंटीबॉडी के बारे में पता । हालांकि, हम हमारी चर्चा में सभी नियमित रूप से परख के वेरिएंट का इस्तेमाल दर्शकों को एक के लिए विशिष्ट जरूरतों को प्रोटोकॉल अनुकूलन का अवसर दे ।
Protocol
Representative Results
Discussion
वहां तीन नियमित रूप से परख synaptic पुटिका (एसवी) रिसाइकिलिंग अध्ययन किया करते थे । पहले दो एक) ऐसे FM1-43 के रूप में फ्लोरोसेंट styryl रंजक का उपयोग शामिल है (जो झिल्ली में शामिल, organelles में endocytosis के दौरान लिया जाता है, और exoc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए Irmgard Weiss को धन्यवाद देते हैं । यह काम नैनोमीटर रेंज और मस्तिष्क के आण्विक फिजियोलॉजी (CNMPB, B1-7, T.D. करने के लिए) में माइक्रोस्कोपी के लिए उत्कृष्टता के क्लस्टर के माध्यम से DFG द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| BSA | Sigma | A7030-50g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306-100g | |
| CoolSNAP HQ2 | Photometrics | ||
| dH2O | Invitrogen | 15230 | |
| DABCO | Merck | 8.03456.0100 | |
| donkey anti mouse Alexa 647 | Jackson-Immunoresearch | 715605151 | antibody |
| DMEM | Invitrogen | 41966 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| tube (50 mL) | Greiner Bio-One | 227261 | |
| FBS superior | BiochromAG | S0615 | |
| Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170 | |
| HEPES | Sigma | H4034-500g | |
| Hera Cell 150 (Inkubator) | ThermoElectron Corporation | ||
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541-500g | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030 | |
| MgCl2 | Honeywell | M0250-500g | |
| microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 21103049 | |
| OpenView Experiment Analysis Application | Free software, see comments | written by Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Optimem | Invitrogen | 31985 | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| safety hood | ThermoElectron | Serial No. 40649111 | |
| Sucrose | neoFroxx | 1104kg001 | |
| Synaptotagmin1 | Synaptic Systems | 105311 | mouse monoclonal; clone 604.2 |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Water bath | GFL | 1004 | |
| Zeiss Observer. Z1 | Zeiss | ||
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