Intravenosa y Intra-amniótico en el útero el trasplante en el modelo murino
Summary
Se describe un protocolo para realizar un trasplante en el útero (IUT) a través de rutas intravenosa e intraamniótica de inyección en el modelo murino. Este protocolo puede utilizarse para introducir las células, vectores virales y otras sustancias en el ambiente fetal inmune tolerante único.
Abstract
En el útero (IUT) es un modo de tratamiento que puede utilizarse para introducir las células madre, vectores virales u otras substancias temprano en la gestación único y versátil. El fundamento IUT para fines terapéuticos se basa en el pequeño tamaño del feto, la inmadurez inmunológica fetal, la accesibilidad y la naturaleza proliferativa de las células madre o progenitoras fetales y el potencial para tratar una enfermedad o la aparición de síntomas antes del nacimiento. Aprovechando estas características del desarrollo normales del feto, la entrega de las células madre hematopoyéticas (HSC) vía un IUT tiene el potencial para el tratamiento de trastornos hematológicos congénitos como enfermedad de células falciformes, sin la necesaria trasplantes de myeloablative o inmunosupresor acondicionado para HSC postnatal. Asimismo, la accesibilidad de células progenitoras en múltiples órganos durante el desarrollo potencialmente permite una selección más eficiente de células madre/progenitoras después un IUT de vectores virales para terapia génica o la edición del genoma. Además, IUT puede ser utilizado para estudiar los procesos del desarrollo normales incluyendo, pero no limitado a, el desarrollo de tolerancia inmunológica. El modelo murino proporciona un medio valioso y asequible a la comprensión de las potencialidades y limitaciones del IUT antes de los grandes estudios en animales y una eventual aplicación clínica. Aquí, describimos un protocolo para realizar un IUT en el feto murino por vías intravenosa e intraamniótica. Este protocolo se ha utilizado con éxito para aclarar las condiciones necesarias y los mecanismos detrás de en el útero el trasplante de células madre hematopoyéticas, inducción de la tolerancia y en el útero la terapia génica.
Introduction
Los avances recientes en el diagnóstico y detección prenatal han sacado a la luz la posibilidad de tratar al feto para un número de enfermedades congénitas que no tienen opciones de tratamiento postnatal adecuada y dar lugar a morbosidad significativa y mortalidad. Específicamente, en el útero del trasplante de células madre hematopoyéticas (IUHCT) y gene terapia genoma edición tienen el potencial para tomar ventaja de las propiedades del desarrollo normales del feto para el tratamiento de congénito hematológica, inmunológica y genética trastornos de la forma más eficiente de postnatal trasplante de HSC y gene terapia genoma edición pueden hacer1,2. Específicamente, debido al pequeño tamaño del feto, la célula donante o dosis de vector viral pueden ser maximizado por el peso del recipiente. Además, la inmadurez inmunológica del feto permite donantes HSCs para inyectar sin la myeloablative y acondicionamiento inmunosupresor es necesaria en los protocolos de trasplante postnatal. Del mismo modo, vectores virales llevando un transgen terapéutico o tecnología de edición del genoma se pueden inyectar sin una respuesta inmune limita el producto del transgen o el vector viral. Por último, la accesibilidad y la naturaleza proliferativa de las células progenitoras fetales de permitirse la posibilidad de una más eficiente transducción de células progenitoras de destino, así como ciertos modos de genoma edición (dirigido por homología reparación) que requieren de ciclismo células se producen eficientemente. El modelo murino sirve como un medio profundo y asequible para tratar asuntos importantes en la célula de vástago Biología e Inmunología antes de la experimentación en modelos preclínicos de animal grandes y, como tal, ha servido como el principal modelo en el que IUHCT y en el útero terapia génica han sido explorados1,2,3.
Aunque muchas variables juegan un papel importante en el éxito de IUHCT y en el útero gene terapia genoma edición en modelos animales murinos y grandes, una variable clave es el método de entrega de las HSCs o vector viral. La entrega de grandes dosis de donante HSCs con un efecto de primer paso que ocurre en el hígado fetal, el órgano hematopoyético en el momento de la IUHCT, se ha demostrado para ser instrumental en el logro de niveles de macrochimeric del engraftment en ratón y en modelos animales grandes4 ,5. Esto fue alcanzada a través de una inyección de donantes las células a través de la vena vitelina en el modelo murino y por medio de una inyección intra cardiaca en el modelo canino. La ruta de inyección también juega un papel fundamental en la orientación de las células progenitoras de los diferentes órganos durante el desarrollo. Por ejemplo, una inyección intravenosa a través de la vena vitelina ha demostrado a transducir eficazmente cardiomiocitos y hepatocitos después de una gestación tardía inyección6,7. Alternativamente, la inyección intraamniótica de vectores virales permite la focalización de los órganos que se exponen físicamente basados en el plegado/desarrollo embrionario en el momento de la inyección de8. Esto se ejemplifica mejor en atacar el epitelio respiratorio a través de una inyección intra amniótico a finales de la gestación aprovechando normal movimientos fetales con “respiración”, que expone las vías respiratorias al vector viral en el amniótico líquido9. Estos dos modos del IUT, intravenosa a través de la vena vitelina e intraamniótica, han sido la base para múltiples experimentos pasados y actuales en nuestro laboratorio. En este protocolo, se describen en detalle los métodos para realizar intravenosa e intraamniótica IUT en el modelo murino.
Protocol
Representative Results
Discussion
En el útero el trasplante es una terapia potencial para muchos trastornos congénitos que se pueden diagnosticar temprano en la gestación. El modelo murino de IUT permite a los investigadores a explorar el entorno fetal o a experimentar con diferentes tratamientos. Dependiendo de lo que es ser inyectado y lo que es blanco, intravenosa o intra-amniótico en el útero el trasplante puede proporcionar una entrega confiable de un injectant en el espacio deseado.
Cuando determin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Gloves | Cardinal Health | 2D73DP65 | |
| Adson Forceps w/ teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Adson Forceps w/o teeth | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Curved scissors | Fine Science Tools | 14075-11 | |
| Heavy Scissors | Fine Science Tools | 14002-13 | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | 12005-15 | |
| Vicryl 2.0 | Ethicon | JB945 | |
| Transfer Pipette | Medline | GSI135010 | |
| Cotton Tipped Applicators | Medline | MDS202000 | |
| 50 mL Conical tube | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| Tape | 3M | 1527-1 | |
| Eye lubricant | Major LubriFresh | 0904-6488 | |
| Heating Pad | K&H | 3060 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | |
| Injector | Narishige | HI01PK01 | |
| Glass Capillary tubes | Kimble | 71900-100 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | |
| IM-300 Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-300 | |
| Insulin Syringe | BD | 305935 | |
| Filter | Genesee Scientific | 25-244 | |
| Compac5 Anesthesia Machine | VetEquip Compac5 | 901812 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| N2 gas | Airgas | NI 125 | |
| O2 gas | Airgas | OX 125 | |
| Ad-GFP viral vector | Penn Vector Core | H5'.040.CMV.eGFP |
References
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