小鼠宫内移植中静脉和羊膜内植入的研究
Summary
我们描述了一个协议, 执行一个在子宫内移植 (IUT) 通过静脉注射和羊膜内注射途径的小鼠模型。该协议可用于将细胞、病毒载体和其他物质引入到独特的免疫耐受性胎儿环境中。
Abstract
在子宫移植 (IUT) 是一种独特的和多才多艺的治疗模式, 可用于引进干细胞, 病毒载体, 或任何其他物质早在妊娠期。IUT 治疗目的背后的基本原理是基于胎儿的小尺寸、胎儿的免疫不成熟、胎儿茎或祖细胞的可及性和增殖性, 以及治疗疾病或症状发作的可能性。出生前。利用胎儿的这些正常发育特性,通过IUT 提供造血干细胞 (HSC) 有可能治疗先天性血液病, 如镰状细胞疾病, 而不需要清髓性或免疫抑制的适应需要的产后 HSC 移植。同样, 在发育过程中, 多器官中祖细胞的可获得性可能允许在基因治疗或基因组编辑的病毒载体 IUT 后更有效地靶向茎/祖细胞。此外, IUT 可用于研究正常的发育过程, 包括但不限于免疫耐受的发展。小鼠模型提供了一个有价值和负担得起的手段, 以了解 IUT 的潜力和局限性之前, 临床大动物研究和最终的临床应用。在这里, 我们描述了一个协议, 以执行 IUT 在小鼠胎儿通过静脉和羊膜内路线。该协议已成功地用于阐明宫内造血干细胞移植、耐受诱导和宫内基因治疗的必要条件和机制。
Introduction
最近在产前筛查和诊断方面的进展, 使人有可能治疗胎儿的一些先天性疾病, 没有足够的产后治疗选择, 并导致严重的发病率和死亡率。具体地说,在子宫内造血干细胞移植 (IUHCT) 和基因治疗/基因组编辑有潜力利用胎儿正常发育特性, 以治疗先天性血液, 免疫和遗传障碍比产后 HSC 移植和基因治疗/基因组编辑可以做1,2。具体来说, 由于胎儿的体积小, 捐献者细胞或病毒载体剂量可以被最大化的每一个受体的重量。此外, 胎儿的免疫不成熟允许捐献者 HSCs 注射, 而不需要清髓性和免疫抑制的条件下, 产后移植协议。同样, 携带治疗性转基因或基因组编辑技术的病毒载体也可以在不受转基因产品或病毒载体的限制免疫反应的情况下注射。最后, 胎儿茎/祖细胞的可得性和增殖性为目标祖细胞提供了更有效的转导的可能性, 以及基因组编辑的某些模式 (同源定向修复), 需要循环细胞有效地发生。小鼠模型是一个有洞察力和负担得起的方法, 以解决干细胞生物学和免疫学的重要问题之前, 实验前的大型动物模型, 并因此, 作为一个主要的模式, 其中 IUHCT 和在子宫内基因治疗已经探索了1,2,3。
虽然许多变量在 IUHCT 的成功和在小鼠和大动物模型中的子宫基因治疗/基因组编辑中起着重要作用, 但关键变量是 HSCs 或病毒载体的传递方法。大剂量的捐献者 HSCs 在胎儿肝脏 (IUHCT 时的造血器官) 中发生的第一次效应, 已被证明有助于在小鼠和大型动物模型中实现植入 macrochimeric 水平4 ,5。这是通过在老鼠模型中通过卵黄静脉注入供体细胞和通过心脏内注射的犬模型来实现的。注射途径在发育过程中对不同器官的祖细胞有重要的靶向作用。例如,通过卵黄静脉静脉注射已证明有效地传感器心肌细胞和肝细胞后, 后期妊娠注射6,7。另外, 羊膜内注射病毒载体允许靶向身体暴露的器官根据胚胎折叠/发展在注射8的时候。这是最好的例证, 通过羊膜腔内注射在妊娠晚期, 以利用正常的胎儿 “呼吸” 运动, 这暴露呼吸道的病毒载体的羊水上皮流体9。这两种模式的 IUT, 静脉注射通过卵黄静脉和羊膜内, 已成为过去和正在进行的实验在我们的实验室的基础。在本议定书中, 我们详细描述了在小鼠模型中执行静脉和羊膜内 IUT 的方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
在子宫移植是一个潜在的治疗许多先天性疾病, 可以诊断早期在妊娠期。IUT 的小鼠模型允许研究人员探索胎儿环境或尝试不同的治疗方法。根据正在注射的东西和被靶向的,在子宫内移植中静脉注射或羊膜腔可以提供可靠的 injectant 到所需的空间。
当靶向特定器官时, 选择合适的胎儿胚胎年龄以及注射技术是很重要的。虽然静脉注射细胞在 E14 是理想的靶向血液的?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Gloves | Cardinal Health | 2D73DP65 | |
| Adson Forceps w/ teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Adson Forceps w/o teeth | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Curved scissors | Fine Science Tools | 14075-11 | |
| Heavy Scissors | Fine Science Tools | 14002-13 | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | 12005-15 | |
| Vicryl 2.0 | Ethicon | JB945 | |
| Transfer Pipette | Medline | GSI135010 | |
| Cotton Tipped Applicators | Medline | MDS202000 | |
| 50 mL Conical tube | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| Tape | 3M | 1527-1 | |
| Eye lubricant | Major LubriFresh | 0904-6488 | |
| Heating Pad | K&H | 3060 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | |
| Injector | Narishige | HI01PK01 | |
| Glass Capillary tubes | Kimble | 71900-100 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | |
| IM-300 Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-300 | |
| Insulin Syringe | BD | 305935 | |
| Filter | Genesee Scientific | 25-244 | |
| Compac5 Anesthesia Machine | VetEquip Compac5 | 901812 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| N2 gas | Airgas | NI 125 | |
| O2 gas | Airgas | OX 125 | |
| Ad-GFP viral vector | Penn Vector Core | H5'.040.CMV.eGFP |
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