Intravenøs og Intra-amniotic In Utero transplantasjon i Murine modellen
Summary
Vi beskriver en protokoll for å utføre en i utero transplantasjon (IUT) gjennom intravenøs og intra-amniotic ruter av injeksjon i murine modellen. Denne protokollen kan brukes å innføre celler, viral vektorer og andre stoffer i unike immun-tolerant fosterets miljøet.
Abstract
In utero transplantasjon (IUT) er en unik og allsidig modus av å innføre stamceller, viral vektorer eller noen andre stoffer tidlig i av svangerskapet. Begrunnelsen bak IUT for terapeutiske formål er basert på den lille størrelsen på fosteret, fosterets immunologic umodenhet, tilgjengelighet og proliferativ natur fosterets stammen eller stamfar celler og potensial til å behandle en sykdom eller utbruddet av symptomene før fødselen. Utnytter normal utviklingsmessige egenskapene av fosteret, levering av blodkreft stamceller (HSC) via en IUT har potensial til å behandle medfødt hematologic sykdommer som sigdcelleanemi, uten de nødvendige myeloablative eller suppressive condition kreves for postnatal HSC transplants. Tilsvarende gir tilgjengelighet av progenitor celler i flere organer under utvikling potensielt en mer effektiv målretting av stammen/stamfar celler etter en IUT viral vektorer for genterapi eller genomet redigering. I tillegg kan IUT bli brukt til å studere normal utviklingsprosesser inkludert, men ikke begrenset til, utviklingen av immunologiske toleranse. Murine modellen gir en verdifull og rimelig måte å forstå muligheter og begrensninger på IUT før pre-klinisk store dyrestudier og en eventuell klinisk anvendelse. Her beskriver vi en protokoll for å utføre en IUT i murine fosteret gjennom intravenøs og intra-amniotic. Denne protokollen er brukt med hell å belyse de nødvendige betingelsene og mekanismene bak i utero blodkreft stilk cellen transplantasjon, toleranse induksjon og i utero genterapi.
Introduction
Nylige fremskritt innen prenatal screening og diagnose har avdekket at behandling av fosteret for en rekke medfødte sykdommer som ikke har tilstrekkelig postnatal behandlingstilbud og resultere i betydelig sykelighet og dødelighet. Spesielt har i utero blodkreft stilk cellen transplantasjon (IUHCT) og gene terapi/genomet redigering potensial til å dra nytte av normal utviklingsmessige egenskaper av fosteret å behandle medfødt hematologic, immun og genetisk lidelser mer effektivt enn postnatal HSC transplantasjon og gene terapi/genomet redigering kan gjøre1,2. Spesielt på grunn av den lille størrelsen på fosteret, kan giveren cellen eller viral vector-dose maksimeres per vekten av mottakeren. I tillegg lar immunologic umodenhet av fosteret donor HSCs skal injiseres uten myeloablative og suppressive condition som kreves i postnatal transplantasjon protokoller. Tilsvarende kan viral vektorer bærer en terapeutisk transgene eller genomet redigering teknologi injiseres uten en begrensende immunrespons transgene produktet eller viral vektoren. Til slutt, tilgjengelighet og proliferativ natur fosterets stammen/stamfar celler råd mulighet for en mer effektiv Albin på målet stamfar celler, samt visse former for genomet redigering (homologi-rettet reparasjon) som krever sykling celler oppstår effektivt. Murine modellen fungerer som en innsiktsfull og rimelig måte å ta opp viktige spørsmål i stem cell biology og immunologi før eksperimentere i pre-klinisk store dyr modeller og, som sådan, har fungert som den primære modellen IUHCT og i utero gene terapi har vært utforsket1,2,3.
Selv om mange variabler spiller en viktig rolle i suksessen til IUHCT og i utero gene terapi/genomet redigering i murine og store dyr modeller, er en viktig variabel metoden for levering av HSCs eller viral vektor. Levering av store doser av donor HSCs med første-pass effekt oppstår i fosterets leveren, blodkreft orgel ved IUHCT, har vist seg å være medvirkende i å oppnå macrochimeric nivåer med engraftment i mus og store dyr modeller4 ,5. Dette var oppnådd via en injeksjon av donor cellene via eggeplomme venen i musemodell og via en intra cardiac injeksjon i hjørnetann modellen. Ruten injeksjon også spiller en grunnleggende rolle i utvelgingen progenitor celler av ulike organer under utvikling. For eksempel en intravenøs injeksjon via eggeplomme åre har vist seg å effektivt transduce cardiomyocytes og hepatocytter etter en sen svangerskapet injeksjon6,7. Alternativt kan en intra-amniotic injeksjon av viral vektorer målretting av organer som fysisk vises basert på embryonale folding/utvikling av injeksjon8. Dette er best eksemplifisert ved målretting av respiratoriske epitel via en intra-amniotic injeksjon sent i svangerskapet for å dra nytte av normal fosterets “puste” bevegelser, som viser luftveiene til viral vektor i den amniotic flytende9. Disse to modusene for IUT, intravenøs via eggeplomme venen og intra-amniotic, har vært grunnlaget for flere pågående og tidligere eksperimenter i vårt laboratorium. I denne protokollen beskrive vi i detalj metodene for å utføre intravenøs og intra-amniotic IUT i murine modellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In utero transplantasjon er en potensiell terapi for mange medfødt lidelser som kan diagnostiseres tidlig i svangerskapet. Murine modell for IUT tillater forskere å utforske fosterets miljøet eller eksperimentere med forskjellige terapi. Avhengig av hva er blitt injisert, og hva er målrettet, gir intravenøs eller intra-amniotic i utero transplantasjon en pålitelig levering av en injectant i den ønskede plassen.
Når målretting bestemte organer, er det viktig å velge …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Gloves | Cardinal Health | 2D73DP65 | |
| Adson Forceps w/ teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Adson Forceps w/o teeth | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Curved scissors | Fine Science Tools | 14075-11 | |
| Heavy Scissors | Fine Science Tools | 14002-13 | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | 12005-15 | |
| Vicryl 2.0 | Ethicon | JB945 | |
| Transfer Pipette | Medline | GSI135010 | |
| Cotton Tipped Applicators | Medline | MDS202000 | |
| 50 mL Conical tube | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| Tape | 3M | 1527-1 | |
| Eye lubricant | Major LubriFresh | 0904-6488 | |
| Heating Pad | K&H | 3060 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | |
| Injector | Narishige | HI01PK01 | |
| Glass Capillary tubes | Kimble | 71900-100 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | |
| IM-300 Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-300 | |
| Insulin Syringe | BD | 305935 | |
| Filter | Genesee Scientific | 25-244 | |
| Compac5 Anesthesia Machine | VetEquip Compac5 | 901812 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| N2 gas | Airgas | NI 125 | |
| O2 gas | Airgas | OX 125 | |
| Ad-GFP viral vector | Penn Vector Core | H5'.040.CMV.eGFP |
References
- Loukogeorgakis, S., Flake, A. In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives. European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).
- Vrecenak, J., Flake, A. In utero hematopoietic cell transplantation: recent progress and the potential for clinical application. Cytotherapy. 15, 525-535 (2013).
- Peranteau, W., et al. Correction of murine hemoglobinopathies by prenatal tolerance induction and postnatal nonmyeloablative allogeneic BM transplants. Blood. 126 (10), 1245-1254 (2015).
- Vrecenak, J., et al. Stable Long-Term Mixed Chimerism Achieved in a Canine Model of Allogeneic in utero Hematopoietic Cell Transplantation. Blood. 124 (12), 1987-1995 (2014).
- Peranteau, W., et al. CD26 Inhibition Enhances Allogeneic Donor-Cell Homing and Engraftment after in utero Hematopoietic-Cell Transplantation. Blood. 108 (13), 4268-4274 (2006).
- Waddington, S., et al. In utero gene transfer of human factor IX to fetal mice can induce postnatal tolerance of the exogenous clotting factor. Blood. 101 (4), 1359-1366 (2003).
- Stitelman, D., et al. Developmental Stage Determines Efficiency of Gene Transfer to Muscle Satellite Cells by in utero Delivery of Adeno-Associated Virus Vector Serotype 2/9. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 1, 14040 (2014).
- Endo, M., et al. Gene Transfer to Ocular Stem Cells by Early Gestational Intraamniotic Injection of Lentiviral Vector. Molecular Therapy. 15 (3), 579-587 (2007).
- Boelig, M., et al. The Intravenous Route of Injection Optimizes Engraftment and Survival in the Murine Model of In utero Hematopoietic Cell Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22 (6), 991-999 (2016).
- Wu, C., et al. Intra-amniotic Transient Transduction of the Periderm with a Viral Vector Encoding TGFβ3 Prevents Cleft Palate in Tgfβ3-/-. Mouse Embryos. Molecular Therapy. 1, 8-17 (2013).
- Roybal, J., Endo, M., Radu, A., Zoltick, P., Flake, A. Early gestational gene transfer of IL-10 by systemic administration of lentiviral vector can prevent arthritis in a murine model. Gene Therapy. 18 (7), 719-726 (2011).
- Reay, D., et al. Full-Length Dystrophin Gene Transfer to the Mdx Mouse in utero. Gene Therapy. 15 (7), 531-536 (2008).
- Ahmed, S., Waddington, S., Boza-Morán, M., Yáñez-Muñoz, R. High-Efficiency Transduction of Spinal Cord Motor Neurons by Intrauterine Delivery of Integration-Deficient Lentiviral Vectors. Journal of Controlled Release. 273, 99-107 (2018).
- Haddad, M., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. Fetal Brain-Directed AAV Gene Therapy Results in Rapid, Robust, and Persistent Transduction of Mouse Choroid Plexus Epithelia. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 2, 101 (2013).
- Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., MacKenzie, T. A mouse model of in utero transplantation. Journal of Visualized Experiments. (47), e2303 (2011).
- Davey, M., et al. Jaagsiekte Sheep Retrovirus Pseudotyped Lentiviral Vector-Mediated Gene Transfer to Fetal Ovine Lung. Gene Therapy. 19 (2), 201-209 (2011).
