Identifiering av havet nejonöga feromoner med hjälp av Bioassay-guidad fraktionering
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att isolera och karakterisera strukturen, lukt potens och beteendemässiga svar av förmodad pheromone föreningar av havet nejonöga.
Abstract
Bioassay-guidad fraktionering är en iterativ metod som använder resultaten av fysiologiska och beteendemässiga bioassays för att vägleda isolering och identifiering av en aktiv feromon förening. Denna metod har resulterat i framgångsrika karakterisering av de kemiska signalerna som fungerar som feromoner i en mängd olika djurarter. Havet nejonöga lita på luktsinnets funktion att upptäcka feromoner som förmedlar beteendemässiga eller fysiologiska svar. Vi använder denna kunskap om fisk biologi att posit funktioner av förmodad feromoner och vägleda isolering och identifiering av aktiva feromon komponenter. Kromatografi används för att extrahera, koncentrera och separata föreningar från konditionerade vattnet. Electro-olfactogram (EOG) inspelningar genomförs för att avgöra vilka fraktioner framkalla olfactory svaren. Två-val labyrint beteendemässiga analyser används sedan för att avgöra om någon av de illaluktande fraktionerna är också behaviorally aktiva och framkalla en preferens. Spektrometriska och spektroskopiska metoder ge molekylvikten och strukturell information att hjälpa till med struktur förtydligandet. Bioaktiviteten av de rena föreningarna bekräftas med EOG och beteendemässiga analyser. Beteendemässiga Svaren observerats i labyrinten bör slutligen valideras i fältet inställningen att bekräfta deras funktion i en naturlig bäck inställning. Dessa bioassays spelar en dubbel roll för att 1) styra processen fraktionering och (2) bekräfta och ytterligare definiera bioaktiviteten av isolerade komponenter. Här, rapportera vi representativa resultaten av en havet nejonöga feromon identifiering som exemplifierar nyttan av metoden bioassay-guidad fraktionering. Identifiering av havet nejonöga feromoner är särskilt viktigt eftersom en modulering av dess feromon kommunikationssystem är bland de alternativ som anses styra den invasiva havet nejonöga i Laurentian stora sjöarna. Denna metod kan lätt anpassas för att karakterisera den kemiska kommunikationen i ett brett spektrum av taxa och belysa vattenburna kemisk ekologi.
Introduction
Feromoner är specifika kemiska signaler som släpptes av individer som hjälpa dem i att hitta födokällor, upptäcka rovdjur och medla sociala interaktioner artfränder1. Feromon kommunikationen i insekter har varit studerade2; dock har kemiska identifiering och biologiska funktionen av vattenlevande ryggradsdjur feromoner inte studerats så ingående. Kunskap om identitet och funktion av de feromoner som släppt kan användas för att underlätta indrivningen av hotade arter3,4 eller kontroll pest arter5,6. Tillämpningen av dessa tekniker kräver isolering och karakterisering av bioaktiva feromon komponenter.
Feromon identifiering är en gren av naturlig produkt kemi. Framsteg i feromon forskning har varit delvis begränsade pågrund av feromon molekylerna själva. Feromoner är ofta instabila och utgivna i små mängder, och endast ett fåtal provtagning tekniker finns för att detektera minuten mängder flyktiga7,8 eller vattenlösliga föreningar9. Metoder att identifiera feromoner inkluderar 1) en riktad screening av kända föreningar, 2) metabolomik och 3) bioassay-guidad fraktionering. En riktad screeningtester av kända föreningar och kommersiellt tillgängliga metaboliska biprodukter av fysiologiska processer hypotes om för att fungera som feromoner. Detta tillvägagångssätt är begränsande eftersom forskare kan bara testa kända och tillgängliga föreningar. Dock har det resulterat i framgångsrika identifiering av könshormoner i goldfish som fungerar som feromoner10,11,12. Metabolomik är en andra feromon identifiering metod som skiljer potentiella småmolekylära metaboliska produkter inom ett biologiskt system13. En jämförelse mellan två grupper (dvs.en aktiv kontra inaktiva utdrag) metaboliska profiler möjliggör identifiering av en potentiell metabola profilen från som metaboliten renas, strukturen är klarlagd, och den bioaktivitet är bekräftade14. Additiva eller synergistiska effekter av komplexa formuleringar av särskilda blandningar är mer benägna att upptäckas med metabolomik eftersom metaboliter betraktas tillsammans i stället för som en serie av fraktioner13. Ännu, genomförandet av metabolomik beroende av tillgången på syntetiska referenser eftersom resulterande data inte underlättar förtydligandet av nya strukturer.
Bioassay-guidad fraktionering är en integrerad, iterativ metod som sträcker sig över två fält: kemi och biologi. Denna strategi använder resultaten av fysiologiska och beteendemässiga bioassays för att vägleda isolering och identifiering av en aktiv feromon förening. En rå extrakt är fractionated av en kemisk egenskap (dvs, molekylstorlek, polaritet, etc.) och testade med electro-olfactogram (EOG) inspelningar och/eller i en bioassay. De bioaktiva komponenterna är sållas bort genom att upprepa dessa steg fraktionering och EOGs eller bioassays. Strukturerna av ren aktiva föreningar belyses av spektrometriska och spektroskopiska metoder, som ger molekylvikten och strukturell information att producera en mall av föreningen ska är synthesizeds. Bioassay-guidad fraktionering kan ge olika metaboliter och potentiellt roman feromoner med unika kemiska skelett som sannolikt förutsägas från den biosyntetiska vägar.
Här beskriver vi bioassay-guidad fraktionering protokollet som används för att isolera och karakterisera bioaktiviteten av manliga havet nejonöga kön pheromone föreningar. Den havet nejonöga (Petromyzon marinus) är en vertebrate idealmodell att studera feromon kommunikation eftersom dessa fiskar är starkt beroende av luktsinnet detektion av kemiska ledtrådar att medla deras anadroma liv historia består av tre olika faser: larver, ungdomsbrottslighet och vuxen. Havet nejonöga larverna gräver ner sig i sediment av sötvatten strömmar, genomgå en drastisk metamorfos och omvandla till ungfisk som migrerar till en sjö eller havet där de snylta stora värd fisk. Efter demontering från värd fisken, migrera vuxna tillbaka till lekbeståndets bäckar, vägledda av de flyttande feromoner som släpptes av stream-resident larver15,16,17,18,19 . Mogna män stiga upp till lekområden, släppa en multi-Component kön feromoner för att locka kompisar, ibland leka för ungefär en vecka och sedan dör15,20. Identifiering av havet nejonöga feromoner är viktigt eftersom en modulering av feromon kommunikationssystem är bland de alternativ som anses styra invasiva havet nejonöga i Laurentian stora sjöarna21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fisken lever i en kemisk värld full av föreningar ännu identifieras. Bioassay-guidad fraktionering har visat sig nödvändigt att identifiera och karaktärisera bioaktiva molekyler som förmedlar många kemiska interaktioner, såsom de som observerades i masu lax31, asiatiska elefanter32och havet nejonöga33, 34,35. Bioassay-guidad fraktionering är ett effektivt tillvägagång…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar den amerikanska geologiska undersökning Hammond Bay biologiska stationen för användningen av deras forskningsanläggningar och personalen av U.S. fisken och djurlivet Service och fiske och Oceans Kanada för att tillhandahålla havet nejonöga. Denna forskning stöds av bidrag från det stora sjöarna fiskerådet till Weiming Li och Ke Li.
Materials
| Premium standard wall borosilicate capillaries with filament | Warner Instruments | G150F-4 | recording and reference electrode (OD 1.5 mm, ID 0.86 mm) |
| Pipette puller instrument | Narishige | PC-10 | pulls electrodes for EOGs |
| Diamond-tipped glass cutter | Generic | cut tip of electrodes for EOG | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | odorant delivery tube for EOG |
| Recording electrode holder E Series straight body with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | ESP-M15N | recording electrode holder |
| Reference electrode holder E Series with handle with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | E45P-F15NH | reference electrode holder |
| 1 mm pin | Warner Instruments | WC1-10 | to bridge reference and recording electrode holders |
| 2 mm pin | Warner Instruments | WC2-5 | to bridge reference and recording electrode holders |
| Agar | Sigma | A1296 | molten agar to fill electrodes |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | 3M KCl to fill electrodes and electrode holders |
| Micropipette microfil | World Precision Instruments | MF28G-5 | to fill electrodes and electrode holders |
| L-Arginine | Sigma | A5006 | positive control odorant for EOG |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Water bath | Custom made | N/A | holds odorants for EOG |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222) | Syndel USA | Tricaine1G | EOG anesthetic |
| Gallamine triethiodide | Sigma | G8134-5G | EOG paralytic |
| 1 mL syringe | BD Biosciences | 301025 | to administer paralytic |
| Subcutaneous needle 26G 5/8 | BD Biosciences | 305115 | to administer paralytic |
| Roller clamp | World Precision Instruments | 14043-20 | adjust flow rate of anesthic into lamprey's mouth |
| Sodium chloride (NaCl) | J.T. Baker | 3624-05 | for preparation of 0.9% saline |
| V-shaped plastic stand as specimen stage | Custom made | N/A | holds lamprey during EOG |
| Plastic trough | Custom made | N/A | holds V-shaped plastic stand during EOG |
| Scalpel Blades – #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | for EOG dissection |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | for EOG dissection |
| Straight ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | for EOG dissection, Dumont #5SF Forceps |
| Curved ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11370-42 | for EOG dissection, Moria MC40B |
| Straight pring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | for EOG dissection |
| Stereomicroscope | Zeiss | Discovery V8 | for EOG dissection |
| Illuminator light | Zeiss | CL 1500 ECO | for EOG dissection |
| Plastic tubing | Generic | to connect re-circulating EOG setup and water baths | |
| Odorant delivery tubing | Custom made | N/A | |
| In line filter and gasket set | Lee Company | TCFA1201035A | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 | to position electrodes and odorant delivery capillary tube |
| Magnetic holding devices | Kanetec | MB-K | |
| Valve driver | Arduino | custom made | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Electromagnetic valve | Lee Company | LFAA1201618H | valve for odor stimulation |
| NeuroLog AC/DC amplifier | Digitimer Ltd. | NL106 | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| NeuroLog DC pre-amplifier with headstage | Digitimer Ltd. | NL102G | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| Low-pass 60 Hz filter | Digitimer Ltd. | NL125 | |
| Digitizer | Molecular Devices LLC | Axon Digidata 1440A | |
| Dell computer (OptiPlex 745) running Axoscope data acquistion software | Molecular Devices LLC | AxoScope version 10.4 | |
| Faraday cage | Custom made | N/A | Electromagnetic noise shielding |
| Two-choice maze | Custom made | N/A | waterproofed marine grade plywood covered with plastic liner |
| Trash pump | Honda | WT30XK4A | fills maze with water from nearby river |
| Peristaltic pump with tubing | Cole Parmer | Masterflex 07557-00 | to adminster odorants in maze |
| Inverter Generator | Honda | EU1000i | powers perstaltic pump |
| Release cage | Custom made | N/A | used to acclimate lamprey in the maze |
| Mesh | Generic | used to contain the dimensions of the maze and minimize water turbulance with mesh rollers | |
| Buckets (5 gallon) | Generic | to mix odorants | |
| Flow meter | Marsh-McBirney | Flo-Mate 2000 | to measure discharge |
| XAD 7 HP resin | Dow chemical | 37380-43-1 | for extraction of conditioned water |
| Methanol | Sigma | 34860 | for extraction of conditioned water |
| Water bath | Yamato | BM 200 | for extraction of conditioned water |
| Freeze dryer | Labconco | CentriVap Concentrator | for extraction of conditioned water |
| chloroform | Sigma | CX1050 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 70-230 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 230-400 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Pre-coated silica gel TLC plates | Sigma | 99571 | for isolation of fraction pools |
| anisaldehyde | Sigma | A88107 | for isolation of fraction pools |
| Sephadex LH-20 | GE Healthcare | 17-0090-01 | for isolation of fraction pools |
| Amberlite XAD 7 HP resin | Sigma | XAD7HP | for extraction of conditioned water |
| 4, 2.5L capacity glass columns | Ace Glass Inc. | 5820 | for extraction of conditioned water |
| Acetone | Sigma | 650501 | for extraction of conditioned water |
| TQ-S TOF LC Mass spectrometer (or equivalent) | Waters Co. | N/A | for structure elucidation |
| Binary HPLC pump | Waters Co. | 1525 | for isolation of fraction pools/compounds |
| Agilent NMR spectrometer, 900MHz (or equivalent) | Agilent | N/A | for structure elucidation |
| Rotovap drying system | Buchi | RII | for extraction of conditioned water |
| UV lamp (254 nm) | Spectronics Co. | ENF-240C | for thin layer chromatography |
References
- Wyatt, T. D. . Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , (2014).
- Zhu, J., et al. Reverse chemical ecology: Olfactory proteins from the giant panda and their interactions with putative pheromones and bamboo volatiles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), E9802-E9810 (2017).
- Leal, W. S. Reverse chemical ecology at the service of conservation biology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), 12094-12096 (2017).
- Carde, R. T., Minks, A. K. Control of moth pests by mating disruption: successes and constraints. Annual Review of Entomology. 40 (1), 559-585 (1995).
- Witzgall, P., Kirsch, P., Cork, A. Sex pheromones and their impact on pest management. Journal of chemical ecology. 36, (2010).
- Cheng, Y. -. n., Wen, P., Dong, S. -. h., Tan, K., Nieh, J. C. Poison and alarm: the Asian hornet Vespa velutina uses sting venom volatiles as an alarm pheromone. Journal of Experimental Biology. 220 (4), 645-651 (2017).
- Howse, P., Stevens, J., Jones, O. T. . Insect Pheromones and Their Use in Pest Management. , (2013).
- Pizzolon, M., et al. When fathers make the difference: efficacy of male sexually selected antimicrobial glands in enhancing fish hatching success. Functional Ecology. 24 (1), 141-148 (2010).
- Stacey, N., Sorensen, P. . Hormones in communication | Hormonal Pheromones Encyclopedia of Fish Physiology. , (2011).
- Kobayashi, M., Sorensen, P. W., Stacey, N. E. Hormonal and pheromonal control of spawning behavior in the goldfish. Fish Physiology and Biochemistry. 26 (1), 71-84 (2002).
- Stacey, N. Hormonally-derived pheromones in teleost fishes. Fish Pheromones and Related Cues. , 33-88 (2015).
- Kuhlisch, C., Pohnert, G. Metabolomics in chemical ecology. Natural Product Reports. 32 (7), 937-955 (2015).
- Prince, E. K., Pohnert, G. Searching for signals in the noise: metabolomics in chemical ecology. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396 (1), 193-197 (2010).
- Teeter, J. Pheromone communication in sea lampreys (Petromyzon marinus): implications for population management. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 2123-2132 (1980).
- Moore, H., Schleen, L. Changes in spawning runs of sea lamprey (Petromyzon marinus) in selected streams of Lake Superior after chemical control. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 1851-1860 (1980).
- Vrieze, L. A., Bergstedt, R. A., Sorensen, P. W. Olfactory-mediated stream-finding behavior of migratory adult sea lamprey (Petromyzon marinus). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 68, (2011).
- Wagner, C. M., Jones, M. L., Twohey, M. B., Sorensen, P. W. A field test verifies that pheromones can be useful for sea lamprey (Petromyzon marinus) control in the Great Lakes. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 63 (3), 475-479 (2006).
- Wagner, C. M., Twohey, M. B., Fine, J. M. Conspecific cueing in the sea lamprey: do reproductive migrations consistently follow the most intense larval odour?. Animal Behaviour. 78, (2009).
- Siefkes, M. J., Winterstein, S. R., Li, W. Evidence that 3-keto petromyzonol sulphate specifically attracts ovulating female sea lamprey Petromyzon marinus. Animal Behaviour. 70, (2005).
- Siefkes, M. J., Steeves, T. B., Sullivan, W. P., Twohey, M. B., Li, W. Sea lamprey control: past, present, and future. Great Lakes Fisheries Policy and Management. , 651-704 (2013).
- Li, K., et al. Three Novel Bile Alcohols of Mature Male Sea Lamprey (Petromyzon marinus) Act as Chemical Cues for Conspecifics. Journal of Chemical Ecology. 43 (6), 543-549 (2017).
- Hird, S. J., Lau, B. P. -. Y., Schuhmacher, R., Krska, R. Liquid chromatography-mass spectrometry for the determination of chemical contaminants in food. TRAC Trends in Analytical Chemistry. 59, 59-72 (2014).
- Little, J. L., Williams, A. J., Pshenichnov, A., Tkachenko, V. Identification of "known unknowns" utilizing accurate mass data and ChemSpider. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23 (1), 179-185 (2012).
- Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nature Protocols. 2 (11), 2692 (2007).
- Kaiser, B., Wright, A. . Draft Bruker XRF Spectroscopy User Guide: Spectral Interpretation and Sources of Interference. , (2008).
- Breitmaier, E., Sinnema, A. . Structure Elucidation by NMR in Organic Chemistry: A Practical Guide. , (1993).
- Seco, J. M., Quinoá, E., Riguera, R. The assignment of absolute configuration by NMR. Chemical Reviews. 104 (1), 17-118 (2004).
- Li, K., et al. Bile Salt-like Dienones Having a Novel Skeleton or a Rare Substitution Pattern Function as Chemical Cues in Adult Sea Lamprey. Organic Letters. , (2017).
- Li, K., Buchinger, T. J., Li, W. Discovery and characterization of natural products that act as pheromones in fish. Natural Product Reports. , (2018).
- Yambe, H., et al. L-Kynurenine, an amino acid identified as a sex pheromone in the urine of ovulated female masu salmon. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15370-15374 (2006).
- Rasmussen, L., Lee, T. D., Zhang, A., Roelofs, W. L., Daves, G. D. Purification, identification, concentration and bioactivity of (Z)-7-dodecen-1-yl acetate: sex pheromone of the female Asian elephant, Elephas maximus. Chemical Senses. 22 (4), 417-437 (1997).
- Sorensen, P. W., et al. Mixture of new sulfated steroids functions as a migratory pheromone in the sea lamprey. Nature Chemical Biology. 1 (6), 324-328 (2005).
- Hoye, T. R., et al. Details of the structure determination of the sulfated steroids PSDS and PADS: New components of the sea lamprey (Petromyzon marinus) migratory pheromone. The Journal of organic chemistry. 72 (20), 7544-7550 (2007).
- Fine, J. M., Sorensen, P. W. Isolation and biological activity of the multi-component sea lamprey migratory pheromone. Journal of Chemical Ecology. 34 (10), 1259-1267 (2008).
- De Buchinger, T. J., Wang, H., Li, W., Johnson, N. S. Evidence for a receiver bias underlying female preference for a male mating pheromone in sea lamprey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 280, (2013).
- De Bruyne, M., Baker, T. Odor detection in insects: volatile codes. Journal of Chemical Ecology. 34 (7), 882-897 (2008).
- Bradshaw, J., Baker, R., Lisk, J. Separate orientation and releaser components in a sex pheromone. Nature. 304 (5923), 265-267 (1983).
- Linn, C., Campbell, M., Roelofs, W. Pheromone components and active spaces: what do moths smell and where do they smell it. Science. 237 (4815), 650-652 (1987).
