Идентификация Морская минога феромоны, используя Bioassay руководствуясь фракционирования
Summary
Здесь мы представляем протокол к изоляции и охарактеризовать структуру, обонятельные потенции и поведенческие реакции предполагаемого феромонов соединений морской миноги.
Abstract
Биопроб руководствуясь Фракционирование это итеративный подход, использующий результаты физиологических и поведенческих bioassays изоляции и выявление активных феромонов соединения. Этот метод привела к успешной характеристика химических сигналов эту функцию как феромоны в широком диапазоне видов животных. Море миноги полагаются на обоняние обнаружить феромоны, которые посредником физиологических или поведенческих реакций. Мы используем эти знания биологии рыб постулировать функций предполагаемым феромоны и направлять изоляции и идентификации компонентов активного феромонов. Хроматография используется для извлечения, сконцентрироваться и отдельных соединений с кондиционерами воды. Электро olfactogram (ЭОГ) записи проводятся для определения, какой фракции вызывают обонятельных ответы. 2 выбор лабиринт поведенческих анализов затем используется для определения если любой из пахучих фракций поведенчески также активны и побудить предпочтение. Спектрометрические и спектроскопические методы предоставляют молекулярный вес и структурной информации для оказания помощи с разяснения структуры. Биологическую чистых соединений подтверждено ЭОГ и поведенческих анализов. Поведенческие реакции, наблюдается в лабиринте в конечном счете должно проверяться в поле параметр для подтверждения их функции в обстановке естественный поток. Эти bioassays играть двойную роль 1) направлять процесс фракционирования и 2) подтвердить и далее определять биологическую изолированных компонентов. Здесь мы приводим представительных результатов идентификации феромонов Морская минога которые иллюстрируют утилита биопроб руководствуясь фракционирование подход. Идентификация Морская минога феромоны особенно важна, потому что модуляции своей коммуникационной системы феромонов среди вариантов считается для контроля инвазивных Морская минога в районе Великих озер в Лаврентийские горы. Этот метод может быть легко адаптирована для характеристики химической связи в широком массиве таксонов и пролить свет на водной основе химической экологии.
Introduction
Феромоны конкретные химические сигналы, выпущенный лицами, которые помогают им в поиске источников питания, обнаружение хищников и посредничество социальных взаимодействий сородичами1. Связь феромоны насекомых была хорошо изучены2; Однако химической идентификации и биологические функции водных позвоночных феромоны не были изучены как широко. Знания о личности и функции феромоны выпустила может применяться для облегчения восстановления угрожаемых видов3,4 или управления вредителей видов5,6. Применение этих методов требует изоляции и характеристика компонентов биоактивные феромонов.
Феромоны идентификации является филиалом натуральный продукт химии. Прогресс в исследованиях феромонов был частично ограничено из-за природы феромоны молекул, сами. Феромоны зачастую нестабильным и выпущенный в небольших количествах, и только несколько методов выборки существуют для обнаружения мизерных количествах летучих7,8 или9водорастворимые соединения. Подходы к идентификации феромоны включают 1) целевой скрининг известных соединений, 2) метаболомики и 3) биопроб руководствуясь фракционирования. Целевые обследования известных соединений коммерчески доступных метаболических побочных продуктов физиологических процессов, предположили, чтобы функционировать как феромоны. Этот подход ограничивает потому что исследователи могут проверять только известных и доступных соединений. Однако это привело к успешной идентификации половых гормонов в золотой рыбки эту функцию как феромоны10,,1112. Метаболомика — это второй феромонов идентификации подход, который отличает потенциальные малые молекулы продуктов метаболизма в биологической системе13. Сравнение метаболические профили двух групп (т.е., активные против неактивного экстракт) позволяет идентифицировать потенциальные метаболических профиля от которого очищается метаболит, осветил структура и биологическую является подтвержденным14. Аддитивные или синергических эффектов сложных формулировок конкретных смесей, скорее всего, быть обнаружены с метаболомики метаболитов, которые считаются вместе, а не как ряд фракций13. Тем не менее реализация метаболомики полагается на наличие синтетических ссылки потому, что полученные данные не способствуют прояснению новых структур.
Руководствуясь биопроб Фракционирование это комплексный итеративный подход, который охватывает два поля: Химия и биология. Этот подход использует результаты физиологических и поведенческих bioassays изоляции и выявление активных феромонов соединения. Незрелая выдержка фракционированный химические свойства (т.е.молекулярный размер, полярности, и т.д.) и протестированы с электро olfactogram (ЭОГ) записи и/или в биопроб. Биологически активных компонентов отсев, повторяя эти шаги фракционирования и EOGs и/или bioassays. Спектрометрический и спектральными методами, которые обеспечивают молекулярный вес и структурной информации для создания шаблона соединения, которые будут обобщены освещены структуры чистой активных соединений. Фракционирование биопроб руководствуясь может принести различных метаболитов и потенциально Роман феромонами с уникальной химической скелеты, которые вряд ли предсказал от биосинтетических пути.
Здесь мы описываем биопроб руководствуясь фракционирование протокол, используемый для изолировать и характеризует биологическую мужчины Морская минога Секс феромоны соединений. Морская минога (Petromyzon marinus) является идеальным позвоночных модель для изучения феромонов коммуникации, потому что эти рыбы полагаются на обонятельные обнаружения химических сигналов посредничать их проходных истории жизни, состоит из трех этапов: личинки, несовершеннолетних и взрослых. Морская минога личинки зарываются в отложениях пресноводной потоков, пройти радикальные метаморфоза и превратить в несовершеннолетних, которые мигрируют в озера или океана, где они паразитируют крупных принимающих рыбы. После отсоединения от принимающей рыбы, взрослые мигрируют обратно в нереста потоки, руководствуясь мигрирующих феромоны, выпущенное поток резидентов личинки15,16,,1718,19 . Зрелые мужчины взойти на время нереста, релиз многокомпонентных Секс феромоны для привлечения товарищей, периодически появляться примерно на неделю и затем умирают15,20. Определение Морская минога феромоны имеет важное значение, потому что модуляции системы связи феромонов среди рассмотренных для контроля инвазивных морской миноги в Лауренциана Великих озер21вариантов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Рыбы живут в химической мире, полном соединений еще должны быть определены. Фракционирование биопроб руководствуясь доказал необходимо определить и охарактеризовать биоактивных молекул, которые посредником многих химических взаимодействий, например теми, которые наблюдались в масу…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим США геологического обследования Хаммонд залив биологической станции для использования их научно-исследовательских учреждений и персонала США рыбы и дикой природы и рыболовства и океанов Канады для предоставления морской миноги. Это исследование было поддержано грантов от Комиссии по рыболовству в районе Великих озер Веймин Li и Ke Li.
Materials
| Premium standard wall borosilicate capillaries with filament | Warner Instruments | G150F-4 | recording and reference electrode (OD 1.5 mm, ID 0.86 mm) |
| Pipette puller instrument | Narishige | PC-10 | pulls electrodes for EOGs |
| Diamond-tipped glass cutter | Generic | cut tip of electrodes for EOG | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | odorant delivery tube for EOG |
| Recording electrode holder E Series straight body with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | ESP-M15N | recording electrode holder |
| Reference electrode holder E Series with handle with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | E45P-F15NH | reference electrode holder |
| 1 mm pin | Warner Instruments | WC1-10 | to bridge reference and recording electrode holders |
| 2 mm pin | Warner Instruments | WC2-5 | to bridge reference and recording electrode holders |
| Agar | Sigma | A1296 | molten agar to fill electrodes |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | 3M KCl to fill electrodes and electrode holders |
| Micropipette microfil | World Precision Instruments | MF28G-5 | to fill electrodes and electrode holders |
| L-Arginine | Sigma | A5006 | positive control odorant for EOG |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Water bath | Custom made | N/A | holds odorants for EOG |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222) | Syndel USA | Tricaine1G | EOG anesthetic |
| Gallamine triethiodide | Sigma | G8134-5G | EOG paralytic |
| 1 mL syringe | BD Biosciences | 301025 | to administer paralytic |
| Subcutaneous needle 26G 5/8 | BD Biosciences | 305115 | to administer paralytic |
| Roller clamp | World Precision Instruments | 14043-20 | adjust flow rate of anesthic into lamprey's mouth |
| Sodium chloride (NaCl) | J.T. Baker | 3624-05 | for preparation of 0.9% saline |
| V-shaped plastic stand as specimen stage | Custom made | N/A | holds lamprey during EOG |
| Plastic trough | Custom made | N/A | holds V-shaped plastic stand during EOG |
| Scalpel Blades – #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | for EOG dissection |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | for EOG dissection |
| Straight ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | for EOG dissection, Dumont #5SF Forceps |
| Curved ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11370-42 | for EOG dissection, Moria MC40B |
| Straight pring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | for EOG dissection |
| Stereomicroscope | Zeiss | Discovery V8 | for EOG dissection |
| Illuminator light | Zeiss | CL 1500 ECO | for EOG dissection |
| Plastic tubing | Generic | to connect re-circulating EOG setup and water baths | |
| Odorant delivery tubing | Custom made | N/A | |
| In line filter and gasket set | Lee Company | TCFA1201035A | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 | to position electrodes and odorant delivery capillary tube |
| Magnetic holding devices | Kanetec | MB-K | |
| Valve driver | Arduino | custom made | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Electromagnetic valve | Lee Company | LFAA1201618H | valve for odor stimulation |
| NeuroLog AC/DC amplifier | Digitimer Ltd. | NL106 | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| NeuroLog DC pre-amplifier with headstage | Digitimer Ltd. | NL102G | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| Low-pass 60 Hz filter | Digitimer Ltd. | NL125 | |
| Digitizer | Molecular Devices LLC | Axon Digidata 1440A | |
| Dell computer (OptiPlex 745) running Axoscope data acquistion software | Molecular Devices LLC | AxoScope version 10.4 | |
| Faraday cage | Custom made | N/A | Electromagnetic noise shielding |
| Two-choice maze | Custom made | N/A | waterproofed marine grade plywood covered with plastic liner |
| Trash pump | Honda | WT30XK4A | fills maze with water from nearby river |
| Peristaltic pump with tubing | Cole Parmer | Masterflex 07557-00 | to adminster odorants in maze |
| Inverter Generator | Honda | EU1000i | powers perstaltic pump |
| Release cage | Custom made | N/A | used to acclimate lamprey in the maze |
| Mesh | Generic | used to contain the dimensions of the maze and minimize water turbulance with mesh rollers | |
| Buckets (5 gallon) | Generic | to mix odorants | |
| Flow meter | Marsh-McBirney | Flo-Mate 2000 | to measure discharge |
| XAD 7 HP resin | Dow chemical | 37380-43-1 | for extraction of conditioned water |
| Methanol | Sigma | 34860 | for extraction of conditioned water |
| Water bath | Yamato | BM 200 | for extraction of conditioned water |
| Freeze dryer | Labconco | CentriVap Concentrator | for extraction of conditioned water |
| chloroform | Sigma | CX1050 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 70-230 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 230-400 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Pre-coated silica gel TLC plates | Sigma | 99571 | for isolation of fraction pools |
| anisaldehyde | Sigma | A88107 | for isolation of fraction pools |
| Sephadex LH-20 | GE Healthcare | 17-0090-01 | for isolation of fraction pools |
| Amberlite XAD 7 HP resin | Sigma | XAD7HP | for extraction of conditioned water |
| 4, 2.5L capacity glass columns | Ace Glass Inc. | 5820 | for extraction of conditioned water |
| Acetone | Sigma | 650501 | for extraction of conditioned water |
| TQ-S TOF LC Mass spectrometer (or equivalent) | Waters Co. | N/A | for structure elucidation |
| Binary HPLC pump | Waters Co. | 1525 | for isolation of fraction pools/compounds |
| Agilent NMR spectrometer, 900MHz (or equivalent) | Agilent | N/A | for structure elucidation |
| Rotovap drying system | Buchi | RII | for extraction of conditioned water |
| UV lamp (254 nm) | Spectronics Co. | ENF-240C | for thin layer chromatography |
References
- Wyatt, T. D. . Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , (2014).
- Zhu, J., et al. Reverse chemical ecology: Olfactory proteins from the giant panda and their interactions with putative pheromones and bamboo volatiles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), E9802-E9810 (2017).
- Leal, W. S. Reverse chemical ecology at the service of conservation biology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), 12094-12096 (2017).
- Carde, R. T., Minks, A. K. Control of moth pests by mating disruption: successes and constraints. Annual Review of Entomology. 40 (1), 559-585 (1995).
- Witzgall, P., Kirsch, P., Cork, A. Sex pheromones and their impact on pest management. Journal of chemical ecology. 36, (2010).
- Cheng, Y. -. n., Wen, P., Dong, S. -. h., Tan, K., Nieh, J. C. Poison and alarm: the Asian hornet Vespa velutina uses sting venom volatiles as an alarm pheromone. Journal of Experimental Biology. 220 (4), 645-651 (2017).
- Howse, P., Stevens, J., Jones, O. T. . Insect Pheromones and Their Use in Pest Management. , (2013).
- Pizzolon, M., et al. When fathers make the difference: efficacy of male sexually selected antimicrobial glands in enhancing fish hatching success. Functional Ecology. 24 (1), 141-148 (2010).
- Stacey, N., Sorensen, P. . Hormones in communication | Hormonal Pheromones Encyclopedia of Fish Physiology. , (2011).
- Kobayashi, M., Sorensen, P. W., Stacey, N. E. Hormonal and pheromonal control of spawning behavior in the goldfish. Fish Physiology and Biochemistry. 26 (1), 71-84 (2002).
- Stacey, N. Hormonally-derived pheromones in teleost fishes. Fish Pheromones and Related Cues. , 33-88 (2015).
- Kuhlisch, C., Pohnert, G. Metabolomics in chemical ecology. Natural Product Reports. 32 (7), 937-955 (2015).
- Prince, E. K., Pohnert, G. Searching for signals in the noise: metabolomics in chemical ecology. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396 (1), 193-197 (2010).
- Teeter, J. Pheromone communication in sea lampreys (Petromyzon marinus): implications for population management. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 2123-2132 (1980).
- Moore, H., Schleen, L. Changes in spawning runs of sea lamprey (Petromyzon marinus) in selected streams of Lake Superior after chemical control. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 1851-1860 (1980).
- Vrieze, L. A., Bergstedt, R. A., Sorensen, P. W. Olfactory-mediated stream-finding behavior of migratory adult sea lamprey (Petromyzon marinus). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 68, (2011).
- Wagner, C. M., Jones, M. L., Twohey, M. B., Sorensen, P. W. A field test verifies that pheromones can be useful for sea lamprey (Petromyzon marinus) control in the Great Lakes. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 63 (3), 475-479 (2006).
- Wagner, C. M., Twohey, M. B., Fine, J. M. Conspecific cueing in the sea lamprey: do reproductive migrations consistently follow the most intense larval odour?. Animal Behaviour. 78, (2009).
- Siefkes, M. J., Winterstein, S. R., Li, W. Evidence that 3-keto petromyzonol sulphate specifically attracts ovulating female sea lamprey Petromyzon marinus. Animal Behaviour. 70, (2005).
- Siefkes, M. J., Steeves, T. B., Sullivan, W. P., Twohey, M. B., Li, W. Sea lamprey control: past, present, and future. Great Lakes Fisheries Policy and Management. , 651-704 (2013).
- Li, K., et al. Three Novel Bile Alcohols of Mature Male Sea Lamprey (Petromyzon marinus) Act as Chemical Cues for Conspecifics. Journal of Chemical Ecology. 43 (6), 543-549 (2017).
- Hird, S. J., Lau, B. P. -. Y., Schuhmacher, R., Krska, R. Liquid chromatography-mass spectrometry for the determination of chemical contaminants in food. TRAC Trends in Analytical Chemistry. 59, 59-72 (2014).
- Little, J. L., Williams, A. J., Pshenichnov, A., Tkachenko, V. Identification of "known unknowns" utilizing accurate mass data and ChemSpider. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23 (1), 179-185 (2012).
- Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nature Protocols. 2 (11), 2692 (2007).
- Kaiser, B., Wright, A. . Draft Bruker XRF Spectroscopy User Guide: Spectral Interpretation and Sources of Interference. , (2008).
- Breitmaier, E., Sinnema, A. . Structure Elucidation by NMR in Organic Chemistry: A Practical Guide. , (1993).
- Seco, J. M., Quinoá, E., Riguera, R. The assignment of absolute configuration by NMR. Chemical Reviews. 104 (1), 17-118 (2004).
- Li, K., et al. Bile Salt-like Dienones Having a Novel Skeleton or a Rare Substitution Pattern Function as Chemical Cues in Adult Sea Lamprey. Organic Letters. , (2017).
- Li, K., Buchinger, T. J., Li, W. Discovery and characterization of natural products that act as pheromones in fish. Natural Product Reports. , (2018).
- Yambe, H., et al. L-Kynurenine, an amino acid identified as a sex pheromone in the urine of ovulated female masu salmon. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15370-15374 (2006).
- Rasmussen, L., Lee, T. D., Zhang, A., Roelofs, W. L., Daves, G. D. Purification, identification, concentration and bioactivity of (Z)-7-dodecen-1-yl acetate: sex pheromone of the female Asian elephant, Elephas maximus. Chemical Senses. 22 (4), 417-437 (1997).
- Sorensen, P. W., et al. Mixture of new sulfated steroids functions as a migratory pheromone in the sea lamprey. Nature Chemical Biology. 1 (6), 324-328 (2005).
- Hoye, T. R., et al. Details of the structure determination of the sulfated steroids PSDS and PADS: New components of the sea lamprey (Petromyzon marinus) migratory pheromone. The Journal of organic chemistry. 72 (20), 7544-7550 (2007).
- Fine, J. M., Sorensen, P. W. Isolation and biological activity of the multi-component sea lamprey migratory pheromone. Journal of Chemical Ecology. 34 (10), 1259-1267 (2008).
- De Buchinger, T. J., Wang, H., Li, W., Johnson, N. S. Evidence for a receiver bias underlying female preference for a male mating pheromone in sea lamprey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 280, (2013).
- De Bruyne, M., Baker, T. Odor detection in insects: volatile codes. Journal of Chemical Ecology. 34 (7), 882-897 (2008).
- Bradshaw, J., Baker, R., Lisk, J. Separate orientation and releaser components in a sex pheromone. Nature. 304 (5923), 265-267 (1983).
- Linn, C., Campbell, M., Roelofs, W. Pheromone components and active spaces: what do moths smell and where do they smell it. Science. 237 (4815), 650-652 (1987).
