Determinação espectrofotométrica de Phycobiliprotein conteúdo em associação Synechocystis
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para determinar quantitativamente o conteúdo de phycobiliprotein na associação Synechocystis , usando um método espectrofotométrico. O procedimento de extração foi aplicado também com sucesso para outras cepas de cianobactérias e algas; no entanto, devido às variações em espectros de absorção do pigmento, é necessário testar as equações espectrofotométricas para cada estirpe individualmente.
Abstract
Este é um protocolo simples para a determinação quantitativa do teor de phycobiliprotein na associação modelo Synechocystis. Phycobiliproteins são os componentes mais importantes de ficobilissoma captadores, as grandes antenas de luz-colheita em cianobactérias e vários táxons de algas. Os ficobilissoma captadores de Synechocystis contêm dois phycobiliproteins: ficocianina e allophycocyanin. Este protocolo descreve uma simples, eficiente e confiável método para a determinação quantitativa de ficocianina e allophycocyanin na associação deste modelo. Comparou-se vários métodos de extração de phycobiliprotein e quantificação espectrofotométrica. O procedimento de extração, conforme descrito neste protocolo foi aplicado também com sucesso para outras cepas de cianobactérias como Cyanothece SP., Synechococcuselongatus, Spirulina sp.,sp intoxicante ., e Nostoc SP., bem como sobre algas vermelhas Porphyridium Dendrobrium. No entanto, os coeficientes de extinção de phycobiliproteins específicas de vários táxons podem diferir e, portanto, recomenda-se validar o método de quantificação espectrofotométrica para cada estirpe única individualmente. O protocolo requer pouco tempo e pode ser executado em qualquer laboratório de Ciências da vida padrão, pois requer equipamento padrão somente.
Introduction
fPhycobiliproteins são complexos de proteína-pigmento hidrossolúvel que representam os componentes principais das antenas de luz-colheita em procariontes cianobactérias (Cyanophyta) e vários táxons eucariontes (Glaucophyta, Rhodophyta e Cryptophyta)1. Eles ocorrem principalmente como complexos supramoleculares chamados ficobilissoma captadores e estão normalmente ligados à superfície das membranas fotossintéticas do lado do estroma, com excepção dos Cryptophyta, onde os phycobiliproteins são localizadas no tilacoides lúmen2. Foram identificados quatro tipos de phycobiliproteins até a data: allophycocyanin o núcleo e o periférico ficocianina, ficoeritrina e phycoerythrocyanin1. Como os principais complexos de luz-colheita, ficobilissoma captadores representam um dos fatores cruciais de produtividade de culturas em massa de algas e cianobactérias. Foi demonstrado que truncamento ficobilissoma captadores pode aumentar o acúmulo de biomassa sob luz forte3. Por outro lado, sob o modesta ou baixa irradiância, o truncamento de antena resultou em taxas de crescimento e acúmulo de biomassa a redução3,4. Phycobiliproteins comercialmente são usados como corantes de alimentos, medicamentos e aditivos alimentares, na indústria de cosmético e como fluorescência sondas com aplicações em citometria de fluxo fluorescentes imunoensaios e de microscopia de fluorescência5.
Este protocolo centra-se na determinação quantitativa de phycobiliproteins na associação modelo Synechocystis. Cianobactérias são os primeiros autotróficos fotossintéticos Membros; Eles têm sido formando da Biosfera da terra por mais de 2,4 bilhões de anos6. Eles jogam um papel crucial nos ciclos biogeoquímicos globais de carbono, nitrogênio, oxigênio e outros elementos. Entre cianobactérias, uma estirpe unicelular Synechocystis ganhou uma posição única, já que foi a primeira associação com o todo o genoma sequenciado7,8, é naturalmente transformável por exógeno DNA9, e Ele executa o crescimento estável e relativamente rápido10,11. Em Synechocystis, o componente central de antena, allophycocyanin, está associado com as proteínas de membrana integrais e a ficocianina anexada está localizada na periferia de membrana tilacoides.
Vários métodos de extração de phycobiliprotein e quantificação são comparados neste protocolo. O procedimento de extração final foi aplicado com êxito Synechocystis, bem como outras estirpes de cianobactérias, incluindo Cyanothece sp de Spirulina SP., Synechococcuselongatus,., intoxicante SP..e Nostoc SP. e foi também aplicado com sucesso algas vermelhas Porphyridium Dendrobrium. Portanto, o método desenvolvido no presente protocolo pode ser considerado como um método universal para a extração de phycobiliprotein. Apesar de alguns dos métodos de extração testados resultaram em rendimentos mais elevados de proteína total, o aqui descrito procedimento de extração, desde o mais alto phycobiliprotein produz juntamente com o menor teor de um resíduo de clorofila na extrato de phycobiliprotein. Redução do teor de clorofila um foi essencial para a correta ficocianina e quantificação espectrofotométrica de allophycocyanin.
Os espectros de absorção de phycobiliprotein pode variar significativamente entre diferentes algas e cianobactérias espécie12,13,14,15,16,17 e até mesmo entre várias cepas de cianobactérias único género18. Portanto, os comprimentos de onda específicos e coeficientes de absorção como usado para a determinação de ficocianina e allophycocyanin em Synechocystis não são geralmente aplicáveis a outras estirpes. Além disso, Synechocystis não contiver ficoeritrina e phycoerythrocyanin que pode ser encontrado em algumas outras algas e cianobactérias. Para a determinação de phycobiliproteins em cepas diferentes Synechocystis, recomenda-se avaliar as equações espectrofotométricas para cada estirpe individualmente.
Embora o protocolo contém duas etapas mais tempo (durante a noite de liofilização de pelotas celulares e extração da proteína 1 hora), o tempo de trabalho total para a quantificação de phycobiliproteins é não mais de 2 horas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve um método simples, rápido e reprodutível para a quantificação do teor de phycobiliprotein na associação modelo Synechocystis. Vários métodos de homogeneização de células, extração de proteínas e quantificação de ficocianina e allophycocyanin são comparados, e o protocolo final representa uma combinação das etapas de cada procedimento único ideais. Como dados representativos, o conteúdo de phycobiliproteins foi quantificado em células de Synechocystis sob cr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Foi adoptado o protocolo de uma anterior publicação de11. T. z., ch. D. e J. Č… foram apoiados pelo Ministério da educação, juventude e desporto da República Checa, no âmbito do programa nacional de sustentabilidade eu (NPU eu), conceder o número LO1415. J. Č… era também apoiada pelos GA CR, Grant number 18-24397S. Acesso aos instrumentos e outras instalações foi apoiado em infra-estrutura checo de investigação para a biologia de sistemas C4SYS (projeto não LM2015055). M. A. S. foi apoiado por uma bolsa da Fundação de ciência russo [n. º 14-14-00904].
Materials
| Synechocystis sp. PCC 6803 | Institut Pasteur, Paris, France | 6803 | Cyanobacterium strain |
| Roti-CELL PBS | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 9143.1 | Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution, pH 7.4 |
| Eppendorf safe-lock tubes | Eppendorf, Hamburk, Germany | 30120086 | Safe-lock tubes 1.5 ml |
| VWR 80-Place Storage System | VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA | 30128-282 | Holder for safe-lock tubes |
| RAININ 100 µl -1000 µl | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 17014382 | Pipette |
| GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8 | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 30389272 | Pipette tips |
| Rotina 420R | Hettich, Kirchlengern, Germany | 4701 | Refrigerated centrifuge for 1.5 ml safe-lock tubes and 15 ml conical centrifuge tubes |
| LCexv 4010 | Liebherr, Bulle, Switzerland | 9005382197172 | Refrigerator and freezer -20 °C |
| Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | EXF24086V | Freezer -80 °C |
| CoolSafe | LaboGene, Lillerød, Denmark | 7.001.000.615 | Freeze dryer |
| UV-2600 | Shimadzu, Kyoto, Japan | UV-2600 | Spectrophotometer |
| Hellma absorption cuvettes, semi Micro | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z600288 | VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0.75-1.5 ml, spectral range 200-2500 nm |
| Silamat S6 | Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein | 602286WU | Homogenizer |
| Solid-glass beads | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z273627 | Glass bead of the diameter 2 mm |
| CPA225D-0CE | Sartorius AG, Göttingen, Germany | SECURA225D-1OBR | Analytical balances |
| C-Phycocyanin from Spirulina sp. | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P2172 | Phycocyanin standard |
| Allophycocyanin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | A7472 | Allophycocyanin standard |
| Bicinchoninic Acid Kit | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | BCA1, B9643 | Complete kit for total proteins determination |
| AlgaeTron | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | AG 130-ECO | Cultivation chamber for E. flasks, with controllable light and atmosphere |
| Photobioreactor | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | FMT-150 | Cultivation equipment for cyanobacteria and algae with completely controllable environment |
| Cellometer | Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA | Auto M10 | Cell counter |
| Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | CLS430791 | 15 ml Centrifuge tube for dry weigth sampling |
| Herasafe KS | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 51024579 | Laminar flow hood |
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