Spektrofotometrisk bestämning av Phycobiliprotein innehåll i Cyanobakterien Synechocystis
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att kvantitativt bestämma phycobiliprotein innehåll i Cyanobakterien Synechocystis med en spektrofotometrisk metod. Extraktionsmetod tillämpades också till andra cyanobakterier och alger stammar; på grund av variationer i pigment Absorptionsspektra är det dock nödvändigt att testa spektrofotometrisk ekvationerna för varje stam individuellt.
Abstract
Detta är ett enkelt protokoll för kvantitativ bestämning av phycobiliprotein innehåll i den modell Cyanobakterien Synechocystis. Phycobiliproteins är de viktigaste komponenterna i phycobilisomes, stora ljus-skörd antenner i cyanobakterier och flera alger taxa. Phycobilisomes av Synechocystis innehåller två phycobiliproteins: phycocyanin och allophycocyanin. Det här protokollet beskriver en enkel, effektiv och tillförlitlig metod för kvantitativ bestämning av både phycocyanin och allophycocyanin i denna modell Cyanobakterien. Vi jämförde flera metoder för phycobiliprotein utvinning och spektrofotometrisk kvantifiering. Extraktionsmetod som beskrivs i detta protokoll tillämpades också till andra cyanobakterier stammar såsom Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., och Nostoc sp., samt att röda alger Porphyridium cruentum. Dock utrotning koefficienter av specifika phycobiliproteins från olika taxa kan variera och därför rekommenderas att validera metoden spektrofotometrisk kvantifiering för varje enskild stam individuellt. Protokollet kräver lite tid och kan utföras i ett laboratorium som standard life science eftersom det kräver endast standardutrustning.
Introduction
fPhycobiliproteins är vattenlösliga pigment-proteinkomplex som representerar stora delar av ljus-skörd antenner i prokaryota cyanobakterier (Cyanophyta) och flera eukaryota taxa (Glaucophyta, Rhodophyta , och Cryptophyta)1. De förekommer främst som Supramolekylära komplex kallas phycobilisomes och de är oftast knutna till ytan av fotosyntetiska membran på stromaceller sida, med undantag för Cryptophyta, där phycobiliproteins är lokaliserade i de tylakoida lumen2. Fyra typer av phycobiliproteins har identifierats upp till datum: den core allophycocyanin och perifera phycocyanin, phycoerythrin och phycoerythrocyanin1. Som de viktigaste ljus-skörd komplex representerar phycobilisomes en av de avgörande faktorerna av alger och cyanobakterier massa kulturer produktivitet. Det har visats att phycobilisomes trunkering kan förbättra biomassa ackumulering under starkt ljus3. Däremot, under blygsamma eller låg irradians resulterade antenn trunkering i tillväxttakten och biomassa ackumulering minskning3,4. Phycobiliproteins används kommersiellt som mat färgämnen, läkemedel och livsmedelstillsatser, i den kosmetiska industrin, samt fluorescens sonder med tillämpningar i flödescytometri, fluorescerande immunanalyser och fluorescence mikroskopi5.
Detta protokoll fokuserar på kvantitativ bestämning av phycobiliproteins i den modell Cyanobakterien Synechocystis. Cyanobakterier är de tidigaste syrerik fotosyntetiska autotrofer; de har bildar jordens biosfär för mer än 2,4 miljarder år6. De har en avgörande roll i globala biogeokemiska cykler av kväve, kol, syre och andra element. Bland cyanobakterier, en encellig stam Synechocystis fick en särställning eftersom det var den första Cyanobakterien med hela genomet sekvenserade7,8, är det naturligt omvandlingsbara av exogent DNA9, och utför stabil och relativt snabb tillväxt10,11. I Synechocystis, antenn Huvudkomponenten, allophycocyanin, är associerade med de integrerad membranproteiner, och den bifogade phycocyanin ligger på tylakoida membran periferin.
Flera metoder för phycobiliprotein utvinning och kvantifiering jämförs i detta protokoll. Den slutliga extraktionsmetod tillämpades till Synechocystissamt till andra cyanobakterier stammar, inklusive Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira SP., och Nostoc sp., och det var också tillämpats korrekt rödalger Porphyridium cruentum. Den metod som utvecklats i detta protokoll kan därför betraktas som en generell metod för extraktion av phycobiliprotein. Även om några av de testade extraktionsmetoder resulterade i högre totalprotein avkastning, här beskrivs extraktionsmetod förutsatt den högsta phycobiliprotein ger tillsammans med det lägsta innehållet av klorofyll en resthalt i den phycobiliprotein extrakt. Att minska innehållet av klorofyll en var viktigt för rätt phycocyanin och allophycocyanin spektrofotometrisk kvantifiering.
Phycobiliprotein vis-absorptionsspektra kan variera betydligt mellan olika alger och cyanobakterier arter12,13,14,15,16,17 och även bland flera stammar av en enda cyanobakterier släkte18. Därför, den specifika våglängder och absorption koefficienter som används för bestämning av phycocyanin och allophycocyanin i Synechocystis är inte allmänt tillämpliga för andra stammar. Dessutom innehåller inte Synechocystis fykoerytrin och phycoerythrocyanin som kan hittas i vissa andra alger och cyanobakterier. För bestämning av phycobiliproteins i stammar än Synechocystisrekommenderas det att utvärdera spektrofotometrisk ekvationerna för varje stam individuellt.
Även om protokollet innehåller två längre steg (övernattning frystorkning av cellulära pellets och 1 timmes protein utvinning), är den totala arbetstid för phycobiliproteins kvantifiering inte längre än 2 timmar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det här protokollet beskriver en enkel, snabb och reproducerbar metod för kvantifiering av phycobiliprotein innehåll i den modell Cyanobakterien Synechocystis. Flera metoder av cell homogenisering, protein utvinning och phycocyanin och allophycocyanin kvantifiering jämförs och slutprotokollet representerar en kombination av de optimala steg för varje enhetligt förfarande. Som representativa data kvantifierades innehållet i phycobiliproteins i Synechocystis celler under ökande ljusintensiteten. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Protokollet antogs från en tidigare publikation11. T. Z., D. Ch. och J. Č. stöddes av ministeriet för utbildning, ungdom och sport i Tjeckien inom nationella hållbarhetsprogrammet jag (NPU jag), bevilja nummer LO1415. J. Č. stöddes också av GA CR, licensnummer 18-24397S. Tillgång till instrument och andra faciliteter stöddes av den tjeckiska forskningsinfrastrukturen för systembiologi C4SYS (projekt nr LM2015055). M. A. S. stöddes av ett bidrag från ryska Science Foundation [nr 14-14-00904].
Materials
| Synechocystis sp. PCC 6803 | Institut Pasteur, Paris, France | 6803 | Cyanobacterium strain |
| Roti-CELL PBS | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 9143.1 | Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution, pH 7.4 |
| Eppendorf safe-lock tubes | Eppendorf, Hamburk, Germany | 30120086 | Safe-lock tubes 1.5 ml |
| VWR 80-Place Storage System | VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA | 30128-282 | Holder for safe-lock tubes |
| RAININ 100 µl -1000 µl | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 17014382 | Pipette |
| GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8 | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 30389272 | Pipette tips |
| Rotina 420R | Hettich, Kirchlengern, Germany | 4701 | Refrigerated centrifuge for 1.5 ml safe-lock tubes and 15 ml conical centrifuge tubes |
| LCexv 4010 | Liebherr, Bulle, Switzerland | 9005382197172 | Refrigerator and freezer -20 °C |
| Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | EXF24086V | Freezer -80 °C |
| CoolSafe | LaboGene, Lillerød, Denmark | 7.001.000.615 | Freeze dryer |
| UV-2600 | Shimadzu, Kyoto, Japan | UV-2600 | Spectrophotometer |
| Hellma absorption cuvettes, semi Micro | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z600288 | VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0.75-1.5 ml, spectral range 200-2500 nm |
| Silamat S6 | Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein | 602286WU | Homogenizer |
| Solid-glass beads | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z273627 | Glass bead of the diameter 2 mm |
| CPA225D-0CE | Sartorius AG, Göttingen, Germany | SECURA225D-1OBR | Analytical balances |
| C-Phycocyanin from Spirulina sp. | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P2172 | Phycocyanin standard |
| Allophycocyanin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | A7472 | Allophycocyanin standard |
| Bicinchoninic Acid Kit | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | BCA1, B9643 | Complete kit for total proteins determination |
| AlgaeTron | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | AG 130-ECO | Cultivation chamber for E. flasks, with controllable light and atmosphere |
| Photobioreactor | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | FMT-150 | Cultivation equipment for cyanobacteria and algae with completely controllable environment |
| Cellometer | Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA | Auto M10 | Cell counter |
| Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | CLS430791 | 15 ml Centrifuge tube for dry weigth sampling |
| Herasafe KS | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 51024579 | Laminar flow hood |
References
- Mimuro, M., Kikuchi, H., Green, B. R., Parson, W. W. Antenna Systems and Energy Transfer in Cyanophyta and Rhodophyta. Light-Harvesting Antennas in Photosynthesis. , 281-306 (2003).
- Spear-bernstein, L., Miller, K. R. Unique location of the phycobiliprotein light-harvesting pigment in the Cryptophyceae. Journal of Phycology. 25 (3), 412-419 (1989).
- Kirst, H., Formighieri, C., Melis, A. Maximizing photosynthetic efficiency and culture productivity in cyanobacteria upon minimizing the phycobilisome light-harvesting antenna size. Biochimica et Biophysica Acta – Bioenergetics. 1837 (10), 1653-1664 (2014).
- Page, L. E., Liberton, M., Pakrasi, H. B. Reduction of photoautotrophic productivity in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 by phycobilisome antenna truncation. Applied and Environmental Microbiology. 78 (17), 6349-6351 (2012).
- Sonani, R. R. Recent advances in production, purification and applications of phycobiliproteins. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 100 (2016).
- Bryant, D. A. . The Molecular Biology of Cyanobacteria. , (1994).
- Kaneko, T., et al. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. I. Sequence features in the 1 Mb region from map positions 64% to 92% of the genome. DNA Research. 2, 191-198 (1995).
- Kaneko, T., et al. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. II. Sequence determination of the entire genome and assignment of potential protein-coding regions. DNA Research. 3, 109-136 (1996).
- Grigorieva, G., Shestakov, S. Transformation in the cyanobacterium Synechocystis sp 6803. FEMS Microbiology Letters. 13 (4), 367-370 (1982).
- Zavřel, T., Sinetova, M. A., Búzová, D., Literáková, P., Červený, J. Characterization of a model cyanobacterium Synechocystis sp: PCC 6803 autotrophic growth in a flat-panel photobioreactor. Engineering in Life Sciences. 15 (1), (2015).
- Zavřel, T., Očenášová, P., Červený, J. Phenotypic characterization of Synechocystis sp. PCC 6803 substrains reveals differences in sensitivity to abiotic stress. PLoS One. 12 (12), e0189130 (2017).
- Bennett, A., Bogorad, L. Complementary chromatic adaption in a filamentous blue-green alga. The Journal of Cell Biology. 58, 419-435 (1973).
- Lüder, U. H., Knoetzel, J., Wiencke, C. Acclimation of photosynthesis and pigments to seasonally changing light conditions in the endemic antarctic red macroalga Palmaria decipiens. Polar Biology. 24 (8), 598-603 (2001).
- Evans, L. V., Lobban, C. S., Chapman, D. J., Kremer, B. P. The effects of spectral composition and irradiance level on pigment levels in seaweeds. Experimental Phycology: A Laboratory Manual. , 123-133 (1988).
- Sampath-Wiley, P., Neefus, C. D. An improved method for estimating R-phycoerythrin and R-phycocyanin contents from crude aqueous extracts of Porphyra (Bangiales, Rhodophyta). Journal of Applied Phycology. 19 (2), 123-129 (2007).
- Chung, Y. H., Park, Y. M., Moon, Y. J., Lee, E. M., Choi, J. S. Photokinesis of Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Journal of Photoscience. 11 (3), 89-94 (2004).
- Sun, L., Gault, P. M., Marler, H. J., et al. Phycobilisomes from Cyanobacteria. Handbook on Cyanobacteria: Biochemistry, Biotechnology and Applications. , 105-160 (2009).
- Six, C., et al. Diversity and evolution of phycobilisomes in marine Synechococcus spp.: A comparative genomics study. Genome Biology. 8 (12), (2007).
- Sinetova, M. A., Červený, J., Zavřel, T., Nedbal, L. On the dynamics and constraints of batch culture growth of the cyanobacterium Cyanothece sp. ATCC 51142. Journal of Biotechnology. 162 (1), (2012).
- Stanier, R. Y., Kunisawa, R., Mandel, M., Cohen-Bazire, G. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales). Bacteriological Reviews. 35 (2), 171-205 (1971).
- Zavřel, T., Sinetova, M. A., Búzová, D., Literáková, P., Červený, J. Characterization of a model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 autotrophic growth in a flat-panel photobioreactor. Engineering in Life Sciences. 15 (1), 122-132 (2015).
- Hemlata, G., Fareha, B. Studies on Anabaena sp. nccu-9 with special reference to phycocyanin. Journal of Algal Biomass Utilization. 2 (1), 30-51 (2011).
- Rito-Palomares, M., Nuez, L., Amador, D. Practical application of aqueous two-phase systems for the development of a prototype process for c-phycocyanin recovery from Spirulina maxima. Journal of Chemical Technology & Biotechnology. 76 (12), 1273-1280 (2001).
- Zhang, H., et al. Selenium-Containing Allophycocyanin Purified from Selenium-Enriched Spirulina platensis Attenuates AAPH-Induced Oxidative Stress in Human Erythrocytes through Inhibition of ROS Generation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59 (16), 8683-8690 (2011).
- Nedbal, L., Trtílek, M., Cervený, J., Komárek, O., Pakrasi, H. B. A photobioreactor system for precision cultivation of photoautotrophic microorganisms and for high-content analysis of suspension dynamics. Biotechnology and Bioengineering. 100 (5), 902-910 (2008).
- Zavřel, T., Knoop, H., Steuer, R., Jones, P. R., Červený, J., Trtílek, M. A quantitative evaluation of ethylene production in the recombinant cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 harboring the ethylene-forming enzyme by membrane inlet mass spectrometry. Bioresource Technology. 202, 142-151 (2016).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Lawrenz, E., Fedewa, E. J., Richardson, T. L. Extraction protocols for the quantification of phycobilins in aqueous phytoplankton extracts. Journal of Applied Phycology. 23 (5), 865-871 (2011).
- Lea-Smith, D. J., et al. Phycobilisome-Deficient Strains of Synechocystis sp. PCC 6803 Have Reduced Size and Require Carbon-Limiting Conditions to Exhibit Enhanced Productivity. Plant Physiology. 165 (2), 705-714 (2014).
- Seo, Y. C., et al. Stable isolation of phycocyanin from Spirulina platensis associated with high-pressure extraction process. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1778-1787 (2013).
- Touloupakis, E., Cicchi, B., Torzillo, G. A bioenergetic assessment of photosynthetic growth of Synechocystis sp. PCC 6803 in continuous cultures. Biotechnology for Biofuels. 8 (1), 133 (2015).
- Touloupakis, E., Cicchi, B., Benavides, A. M. S., Torzillo, G. Effect of high pH on growth of Synechocystis sp. PCC 6803 cultures and their contamination by golden algae (Poterioochromonas sp.). Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1333-1341 (2016).
- Ishii, A., Hihara, Y. An AbrB-Like Transcriptional Regulator, Sll0822, Is Essential for the Activation of Nitrogen-Regulated Genes in Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Physiology. 148 (1), 660-670 (2008).
