Summary

Dynamische Proteomic und MiRNA Analyse des Polysomes von isolierten Maus Herz nach Langendorff Perfusion

Published: August 29, 2018
doi:

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Polysome Profilierung auf das Herz isoliert PERFUNDIERTEN Maus durchführen. Wir beschreiben Methoden für Herz Perfusion, Polysome Profilierung und Analyse der Polysome Fraktionen in Bezug auf mRNAs, MiRNAs und Polysome Proteom.

Abstract

Studien in dynamischen Änderungen im Protein Übersetzung erfordern spezialisierte Methoden. Hier untersuchten wir Veränderungen in neu synthetisierten Proteine als Reaktion auf Ischämie und Reperfusion mit isoliert PERFUNDIERTEN Maus Herzen gepaart mit Polysome Profilierung. Um die dynamischen Änderungen im Protein Übersetzung besser zu verstehen, wir zeichnen die mRNAs, die wurden mit cytosolische Ribosomen (Polyribosomes oder Polysomes) geladen und auch erholt mitochondriale Polysomes und verglichen mRNA und Protein-Verteilung in der Hocheffizienz Fraktionen (zahlreiche Ribosomen an mRNA befestigt), niedrig-Effizienz (weniger Ribosomen befestigt) darunter auch mitochondriale Polysomes und die Fraktionen nicht übersetzen. MiRNAs können auch mit mRNAs, die übersetzt werden werden, wodurch die Effizienz der Übersetzung zuordnen, untersuchten wir die Verteilung der MiRNAs in die Brüche. Die Verteilung der mRNAs, MiRNAs und Proteine wurde unter basalen PERFUNDIERTEN Bedingungen am Ende des 30 min des globalen keine-Flow-Ischämie und nach 30 min der Reperfusion untersucht. Hier präsentieren wir Ihnen die Methoden verwendet, um diese Analyse zu erreichen – unter anderem wurde der Ansatz zur Optimierung der Proteingewinnung aus Saccharose Neigung, als dies nicht vor beschrieben — und einige repräsentative Ergebnisse liefern.

Introduction

Das Herz reagiert auf die Verletzung von (I) Ischämie und Reperfusion (R) in einer dynamischen Art und Weise. Allerdings gibt es wenig Einblick in akute Veränderungen bei der Proteinsynthese während der Reaktion. Um dieses Problem anzugehen, wir nutzten die etablierte Methode der Polysome Profilierung1 zur Identifizierung von Änderungen im Protein-Überfluss, die Umverteilung von Ribosomen und Translationale regulatorische Faktoren vom Zytosol zu Polysomes, zu reflektieren und die Anstieg der neu synthetisierten Proteine (NSP). In der Umgebung von I / R, die Zunahme der neuen Protein-Synthese erfolgt in einem Zeitrahmen, die nicht übereinstimmen mit Transkription des neuen mRNAs2; Darüber hinaus wurde Discordance zwischen mRNA Ausdruck und Protein Fülle gemeldeten3. Aus diesen Gründen haben wir die Änderungen in der dynamischen Proteomforschung zu analysieren, wie Protein Übersetzung widerspiegelt. Um dies zu tun, wir mRNA in den Polysome Fraktionen zu quantifizieren, und analysieren die Proteinzusammensetzung in den Polysome Fraktionen. Schließlich, da MicroRNAs (MiRs) Verfügbarkeit von mRNAs für die Übersetzung zu regulieren und Effizienz von Protein Übersetzung4,5stören können, untersuchten wir die Verteilung der MiRs in den Polysome Fraktionen, mit Schwerpunkt auf der Antwort auf I / r.

Wir entschieden uns für die isolierten Langendorff Perfusion Mausmodell und geernteten Gewebe unter basalen Bedingungen der kontinuierliche Perfusion, nach 30 min global keine-Flow-Ischämie und nach 30 min von Ischämie, gefolgt von 30 min der Reperfusion verwenden. Wir dann solubilisiert Herzgewebe und Polysomes über einen Saccharose Gradienten getrennt gefolgt von Proteomic Analysen und selektive Detektion von mRNAs und MiRNAs durch PCR und Microarray, beziehungsweise. Diese Kombination von Methoden steht einen leistungsfähigen Ansatz zum Verständnis der dynamischen Proteom, ermöglicht simultane Detektion von mRNA und MiRNA, Nadel-, sowie die Umverteilung von regulatorischen Proteinen, MiRNA und mRNA zwischen nontranslating Brüchen, niedrige Effizienz Polysomes und Hochleistungs-Polysomes (siehe Abbildung 1). Einblicke in die dynamische Regulierung dieses Prozesses werden durch weitere Analysen der Phosphorylierung wichtige regulatorische Faktoren wie eIF2α oder mTOR verlängert werden. Diese einzelnen Schritte sind nun detailliert beschrieben.

Protocol

Alle Tierversuche in Übereinstimmung mit Richtlinien durchgeführt und von der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee of Cedars-Sinai Medical Center genehmigt. (1) Langendorff Perfusion der Maus Herz Langendorff Perfusion der Maus Herz mit Ischämie und reperfusion Verwalten intraperitoneale Pentobarbital-Natrium 70 mg/kg an die Erwachsenen Maus (8 Woche alt, männlich, C57BL6/j). Bestätigen Sie Tiefe Narkose durch Mangel an Rückzug bis zu d…

Representative Results

mRNA-AnalysemRNA-Ergebnisse können als Gewinnausschüttung einer bestimmten mRNA in jedem Bruchteil (Abbildung 3A); Kombinieren Sie für die Quantifizierung polyribosomal Übersetzung Brüche und vergleichen Sie nicht übersetzen Bruchteil (Abb. 3 b), präsentiert ein Verhältnis von mRNA Fülle nontranslating Fraktionen zu übersetzen. Weitere Informationen gewinnt man durch die Untersuchung der hocheffiziente Poly…

Discussion

Polysome Profilanalyse ermöglicht die Untersuchung von Protein-Übersetzung durch die Analyse von translationalen Bundesstaat eine spezifische mRNA oder die ganze Transkriptom-6,7. Es ist auch eine große Hilfe, wenn lokale Übersetzung werden, wie z. B. Synaptosomes8 untersucht muss. Diese Methode umfasst traditionell die Trennung von Mono – und Polyribosomes und die damit verbundenen mRNAs auf einer Saccharose-Steigung welche mit genom…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NIH P01 HL112730 (RAG, JVE), NIH R01 HL132075 (RAG, JVE), Barbra Streisand Frauen-Herz-Zentrum (RAG, JVE), Dorothy und E. Phillip Lyon Stuhl in Molekulare Kardiologie (RAG), Erika Glazer Stiftungslehrstuhl im Herzgesundheit der Frau (JVE) und Tschechische Akademie der Wissenschaften Institutionelle Unterstützung RVO: 68081715 (MS).

Materials

Pentobarbital Vortech Phamaceuticals 9373 for euthansia
Heparin Sagent 103424 used in langendorff preparation
forceps Fine Science Tools 91110-10 used to hang the heart
Langendorff system Radnoti + home made n/a A 'four heart' system consisting of custom blown glass, tubing and water baths
NaCl Sigma S7653-5KG Krebs buffer and Sucrose gradient
KCl Sigma P5405 Krebs buffer and Lysis buffer
KH2PO4 Sigma P-5504 Krebs buffer
MgSO4 Sigma M7774-500G Krebs buffer
Glucose Sigma G5767 Krebs buffer
CaCl2 Sigma C1016-500G Krebs buffer
Sucrose powder Sigma S0389-1KG Sucrose gradient
MgCl2 Sigma 208337 Sucrose gradient and Lysis buffer
Tris-base Sigma T1503-1KG Sucrose gradient and Lysis buffer
Xylene Cyanole Sigma X-4126 Sucrose gradient
Cycloheximide Sigma-aldrich 239763 Sucrose gradient and Lysis buffer
RNaseOUT Life Technologies C00019 RNAse inhibitor for Lysis buffer
Igepal CA-360 (NP40) Sigma I3021 Lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail tablets, EDTA free Roche 5056489001
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 x 89 mm Beckman Coulter 344059
Ultracentrifuge Beckman LE-80K Ultracentrifugation of the gradients
Rotor Beckman SW41 Ultracentrifugation of the gradients
Biologic LP (pump) Biorad 731-8300 Fractionation of the gradients
BioFrac Biorad 741-0002 Fractionation of the gradients
Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL tube Sigma Z666513-100EA Gradient fraction and RNA extraction
TRIzol Reagent Life technologies AM9738 RNA extraction
Luciferase Control RNA Promega L4561 RNA extraction
Chloroform Fisher Scientific C606-4 RNA extraction
Glycogen, RNA grade Thermo Fisher Scientific R0551 RNA extraction
Isopropanol Sigma I9516 RNA extraction
Ethanol Sigma E7023-1L RNA extraction
iScript cDNA Synthesis Kit BioRad 170-8891 Reverse transcription
iTaq Universal SYBR Green Supermix BioRad 175-5122 Quantative PCR
miRNeasy Micro Kit (50) Qiagen 217084 Kit for total RNA isolation
miScript II RT Kit (50) Qiagen 218161 Kit for miRNA reverse transcription
miScript Sybr Green PCR Kit (200) Qiagen 218073 Kit for real-time PCR expression analysis of miRNAs
Centrifuge 5424R Eppendorf For centrifugation of 1.5ml or 2.0ml tubes at different temperatures. Max speed – 21130g
Centrifuge 5810R Eppendorf For real-time PCR plate centrifugation at different temperatures. Max speed – 2039g
My Cycler Thermal Cycler Bio-Rad For reverse transcription
CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad For real-time PCR analysis
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control Qiagen 219610 For quality control of RNA isolation
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear Bio-Rad HSP9641 For real-time PCR analysis
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical Bio-Rad MSB1001 For real-time PCR plate sealing
Research plus Single-Channel Pipette, Gray; 0.5-10 µL Eppendorf UX-24505-02 For pipetting
PIPETMAN Classic Pipets, P20 Gilson F123600G For pipetting
PIPETMAN Classic Pipets, P200 Gilson F144565 For pipetting
Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µL Gilson 17011782 For pipetting
Glycogen, RNA grade Thermo Fisher Scientific R0551 Improves total RNA isolation efficiency
Posi-Click 1.7 mL Tubes, natural color Denville C2170 RNA isolation and storage; reagent mix
Thermal Cycling Tubes -0.2 mL Individual Caps, Standard 0.2 mL tubes with optically Denville C18098-4 (1000910) Reverse transcription reaction
Sharp 10 Precision barrier Tips Denville P1096-FR For pipetting
Sharp 20 Precision barrier Tips Denville P1121 For pipetting
Sharp 200 Precision barrier Tips Denville P1122 For pipetting
Tips LTS 1 mL Filter Rainin RT-L1000F For pipetting
miScript Primer Assay (200) Qiagen (it changes according to the miRNA) For real-time PCR analysis
Gradient Master ver 5.3 Model 108 BioComp Instruments For preparation of sucrose gradients
trichloroacetic acid Sigma Aldrich T6399
acetone Sigma Aldrich 650501
Tris hydrochloride Amresco M108
dithiothreitol Fisher Scientific BP172
iodoacetamide Gbiosciences RC-150
sequencing grade modified trypsine, porcine Promega V5111
ammonium bicarbonate BDH BDH9206
formic acid, Optima LC/MS Fisher Chemical A117
methanol, Optima LC/MS Fisher Chemical A454
acetonitrile, Optima LC/MS Fisher Chemical A996
Protein LoBind tubes 0.5 mL Eppendorf AG 22431064
Protein LoBind tubes 1.5 mL Eppendorf AG 22431081
HLB µElution plate 30 µm Oasis 186001828BA
SpeedVac concentrator Thermo Scientific Savant SPD2010
sonicator Qsonica Oasis180
centrifuge Thermo Scientific Sorvall Legend micro 21R
LC trap column PepMap 100 C18 Thermo Scientific 160454
LC separation column PepMap RSLC C18 Thermo Scientific 164536
mass spectrometer Thermo Scientific Orbitrap Elite ion trap mass spectrometer
MSConvert software ProteoWizard Toolkit
Sorcerer-SEQUEST software Sage-N Research, Inc.

References

  1. Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D’Amico, S., Cecconi, F. Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression. PLoS ONE. 10, e0129750 (2015).
  2. Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M., Gottlieb, R. A. Mitophagy and mitochondrial biogenesis in atrial tissue of patients undergoing heart surgery with cardiopulmonary bypass. JCI Insight. 2, e89303 (2017).
  3. Kislinger, T., Cox, B., Kannan, A., Chung, C., Hu, P., Ignatchenko, A., Scott, M. S., Gramolini, A. O., Morris, Q., Hallett, M. T., Rossant, J., Hughes, T. R., Frey, B., Emili, A. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: Combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
  4. Kren, B. T., Wong, P. Y., Shiota, A., Zhang, X., Zeng, Y., Steer, C. J. Polysome trafficking of transcripts and micrornas in regenerating liver after partial hepatectomy. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, G1181-G1192 (2009).
  5. Gottlieb, R. A., Pourpirali, S. Lost in translation: Mirnas and mrnas in ischemic preconditioning and ischemia/reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 95, 70-77 (2016).
  6. Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
  7. Lorsch, J. Methods in enzymology. Laboratory methods in enzymology: Rna. Preface. Methods in Enzymology. 530, xxi (2013).
  8. Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mrnas. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
  9. He, S. L., Green, R. Polysome analysis of mammalian cells. Methods in Enzymology. 530, 183-192 (2013).
  10. Molotski, N., Soen, Y. Differential association of micrornas with polysomes reflects distinct strengths of interactions with their mrna targets. RNA. 18, 1612-1623 (2012).
  11. Maroney, P. A., Yu, Y., Fisher, J., Nilsen, T. W. Evidence that micrornas are associated with translating messenger rnas in human cells. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1102-1107 (2006).
  12. Paul, P., Chakraborty, A., Sarkar, D., Langthasa, M., Rahman, M., Bari, M., Singha, R. S., Malakar, A. K., Chakraborty, S. Interplay between mirnas and human diseases. Journal of Cellular Physiology. 233, 2007-2018 (2018).
  13. Rupaimoole, R., Slack, F. J. Microrna therapeutics: Towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 203-222 (2017).
  14. Nelson, P. T., Hatzigeorgiou, A. G., Mourelatos, Z. Mirnp:Mrna association in polyribosomes in a human neuronal cell line. RNA. 10, 387-394 (2004).
  15. Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a mirna blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1108-1114 (2006).
  16. Kim, J., Krichevsky, A., Grad, Y., Hayes, G. D., Kosik, K. S., Church, G. M., Ruvkun, G. Identification of many micrornas that copurify with polyribosomes in mammalian neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 360-365 (2004).
  17. Androsavich, J. R., Chau, B. N., Bhat, B., Linsley, P. S., Walter, N. G. Disease-linked microrna-21 exhibits drastically reduced mrna binding and silencing activity in healthy mouse liver. RNA. 18, 1510-1526 (2012).
  18. Kraushar, M. L., Thompson, K., Wijeratne, H. R., Viljetic, B., Sakers, K., Marson, J. W., Kontoyiannis, D. L., Buyske, S., Hart, R. P., Rasin, M. R. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the rna-binding protein hu antigen r. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , E3815-E3824 (2014).
  19. McClatchy, D. B., Ma, Y., Liu, C., Stein, B. D., Martinez-Bartolome, S., Vasquez, D., Hellberg, K., Shaw, R. J., Yates, J. R. Pulsed azidohomoalanine labeling in mammals (palm) detects changes in liver-specific lkb1 knockout mice. Journal of Proteome Research. 14, 4815-4822 (2015).
  20. Schiapparelli, L. M., McClatchy, D. B., Liu, H. H., Sharma, P., Yates, J. R., Cline, H. T. Direct detection of biotinylated proteins by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13, 3966-3978 (2014).
  21. Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6, 359-362 (2009).
  22. Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate. Protein Science. 18, 980-993 (2009).
  23. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).
  24. Sashital, D. G., Greeman, C. A., Lyumkis, D., Potter, C. S., Carragher, B., Williamson, J. R. A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30s subunit assembly in e. Coli. Elife. 3, (2014).
  25. Liang, S., Bellato, H. M., Lorent, J., Lupinacci, F. C. S., Oertlin, C., van Hoef, V., Andrade, V. P., Roffé, M., Masvidal, L., Hajj, G. N. M., Larsson, O. Polysome-profiling in small tissue samples. Nucleic Acids Research. 46, e3 (2018).

Play Video

Cite This Article
Stastna, M., Thomas, A., Germano, J., Pourpirali, S., Van Eyk, J. E., Gottlieb, R. A. Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion. J. Vis. Exp. (138), e58079, doi:10.3791/58079 (2018).

View Video