इस प्रोटोकॉल चिकित्सकीय स्टेम मानव दंत कूप से निकाले कोशिकाओं के क्षणिक आनुवंशिक इंजीनियरिंग का वर्णन । लागू गैर वायरल संशोधन रणनीति चिकित्सकीय स्टेम सेल उत्पादों के सुधार के लिए एक आधार बन सकता है ।
तिथि करने के लिए, विभिंन विकासात्मक चरणों में कई स्टेम सेल प्रकार अपक्षयी रोगों के उपचार के लिए ध्यान में हैं । फिर भी, कुछ पहलुओं, जैसे प्रारंभिक बड़े पैमाने पर कोशिका मृत्यु और कम उपचारात्मक प्रभाव, उनके व्यापक नैदानिक अनुवाद बिगड़ा । प्रत्यारोपण करने से पहले स्टेम कोशिकाओं के आनुवंशिक इंजीनियरिंग चिकित्सकीय स्टेम सेल प्रभाव का अनुकूलन करने के लिए एक आशाजनक विधि के रूप में उभरा । हालांकि, सुरक्षित और कुशल जीन डिलिवरी सिस्टम अभी भी कमी है । इसलिए, उपयुक्त विधियों का विकास स्टेम सेल आधारित उपचारों में वर्तमान चुनौतियों का समाधान करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान कर सकता है ।
वर्तमान प्रोटोकॉल निष्कर्षण और मानव दंत कूप स्टेम सेल (hDFSCs) के रूप में अच्छी तरह के रूप में उनके गैर वायरल आनुवंशिक संशोधन के लक्षण वर्णन । जन्मोत्तर दंत कूप उच्च प्रसार क्षमता रखने वयस्क multipotent स्टेम सेल कटाई के लिए एक होनहार और आसानी से सुलभ स्रोत के रूप में अनावरण किया । वर्णित अलगाव प्रक्रिया प्रभावित ज्ञान दांत से hDFSCs फसल के लिए एक सरल और विश्वसनीय तरीका प्रस्तुत करता है । इसके अलावा इस प्रोटोकॉल के लिए अलग कोशिकाओं के स्टेम सेल विशेषताओं को परिभाषित करने के तरीके शामिल हैं । hDFSCs के आनुवंशिक इंजीनियरिंग के लिए, एक अनुकूलित cationic लिपिड आधारित अभिकर्मक रणनीति साइटोटोक्सिक प्रभाव के कारण के बिना अत्यधिक कुशल microRNA परिचय को सक्षम करने के लिए प्रस्तुत किया है । MicroRNAs परिवर्तनीय सेल हेरफेर के लिए उपयुक्त उंमीदवार हैं, के रूप में इन छोटे शोधों नियामकों स्थिर जीनोम एकीकरण के खतरे के बिना भाग्य और स्टेम सेल के व्यवहार को नियंत्रित करते हैं । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल hDFSCs कि उनके चिकित्सीय प्रभावकारिता के अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है इंजीनियरिंग के लिए एक सुरक्षित और कुशल प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है ।
मानव दंत कूप एक ढीला ectomesenchymally है संयोजी विकासशील दांत1,2आसपास के ऊतक व्युत्पंन । अपने कार्य के बगल में दांत विस्फोट प्रक्रिया के लिए osteoclastogenesis और आस्टियोजेनेसिस समंवय करने के लिए, इस ऊतक periodontium3,4,5के विकास के लिए विशेष रूप से स्टेम और जनक कोशिकाओं बंदरगाहों । इसलिए, दंत कूप मानव वयस्क स्टेम सेल6,7फसल के लिए एक वैकल्पिक स्रोत के रूप में माना जाता है ।
कई अध्ययनों से प्रदर्शन किया है कि मानव दंत कूप स्टेम सेल (hDFSCs) osteoblasts, बंध fibroblasts और cementoblasts8,9,10 सहित periodontal वंश में अंतर करने में सक्षम हैं . इसके अलावा, इन कोशिकाओं को आत्म-नवीकरण क्षमता, प्लास्टिक पालन, विशिष्ट सतह मार्करों की अभिव्यक्ति (जैसे, CD73, CD90, CD105) के रूप में अच्छी तरह से osteogenic सहित mesenchymal stromal कोशिकाओं (MSCs) के सभी विशेषताओं से मेल करने के लिए दिखाया गया है, adipogenic र chondrogenic विभेद संभावित११,१२,१३। अंय अध्ययनों से भी पता चला hDFSCs2,14,15,16,17,18के तंत्रिका विभेद की क्षमता ।
उनके होनहार गुणों और आसान पहुंच के कारण, hDFSCs हाल ही में ऊतक इंजीनियरिंग19,20,21के लिए प्रासंगिक बन गया । पहला अध्ययन DFSCs की क्षमता पर केंद्रित करने के लिए अस्थि, periodontal और दांत जड़ों19,22,23,24,25,26, पुनर्जंम 27,28,29,30. hDFSCs की तंत्रिकाजन्य क्षमता के ज्ञान के बाद से, neurodegenerative रोगों के लिए संभावित उपचार के रूप में उनके आवेदन31,३२,३३की जांच की गई है । HDFSCs भी अंय ऊतकों (जैसे, corneal उपकला)३४,३५के उत्थान के लिए संमान के साथ महत्व प्राप्त किया है । hDFSC की चिकित्सीय क्षमता न केवल उनके प्रत्यक्ष विभेदक क्षमता पर आधारित है बल्कि उनकी paracrine गतिविधि पर भी निर्भर करती है । हाल ही में, hDFSCs इस तरह के मैट्रिक्स metalloproteinases (MMPs), इंसुलिन जैसे विकास कारक (IGF), संवहनी endothelial वृद्धि कारक (वीईजीएफ़), बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF) और hepatocyte वृद्धि के रूप में सक्रिय कारकों, के एक धन स्रावित करने के लिए दिखाया गया है फैक्टर (एचजीएफ), जो angiogenesis के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, चुहियों, अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स remodeling और प्रतिकारक प्रक्रियाओं३६।
हालांकि, स्टेम सेल थेरेपी के व्यापक नैदानिक अनुवाद अभी भी कई चुनौतियों से ख़राब है, जैसे बड़े पैमाने पर प्रारंभिक सेल मौत और कम लाभकारी स्टेम सेल प्रभाव३७,३८। आनुवंशिक इंजीनियरिंग इन चुनौतियों का पता करने के लिए एक आशाजनक रणनीति प्रदान करता है और इसलिए बहुत स्टेम कोशिकाओं३८,३९,४०की चिकित्सीय प्रभावकारिता को बढ़ा सकते हैं । क्षणिक कोशिका हेरफेर के लिए, microRNAs (miRs) उपयुक्त उंमीदवार हैं, के रूप में इन छोटे शोधों नियामकों स्थिर जीनोम एकीकरण के जोखिम के बिना स्टेम सेल के भाग्य और व्यवहार को नियंत्रित४१,४२, ४३. तिथि करने के लिए, कई लाभकारी miRs स्टेम सेल प्रसार को बढ़ावा देने की पहचान की गई है, अस्तित्व, होमिंग, paracrine गतिविधि के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कई प्रजातियों में उनके भेदभाव४४. उदाहरण के लिए, मीर-133a इंजीनियर MSCs एक वृद्धि की उत्तरजीविता दिखाया और infarcted चूहा दिल में engraftment एक बेहतर हृदय समारोह में जिसके परिणामस्वरूप जब unmodified MSCs४५की तुलना में । इसी तरह, मीर-146a व्यक्त MSCs वीईजीएफ़ के उच्च मात्रा में जो बारी में कोरोनरी ऊतक४६में एक बढ़ाया चिकित्सकीय दक्षता के नेतृत्व में स्रावित करने के लिए दिखाया गया.
इस पांडुलिपि चयनात्मक निष्कर्षण और hDFSCs के आनुवंशिक इंजीनियरिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है । इस प्रयोजन के लिए, हम मानव दंत कूप के संचयन और एंजाइमी पाचन के साथ ही hDFSCs के बाद के अलगाव का वर्णन किया । आदेश में अलग कोशिकाओं की विशेषता के लिए, एमएससी संपत्तियों के सत्यापन के लिए महत्वपूर्ण निर्देश के अनुसार सेलुलर चिकित्सा13के लिए इंटरनेशनल सोसायटी के दिशा निर्देशों के साथ शामिल किया गया है । इसके अलावा, हम एक cationic लिपिड आधारित अभिकर्मक रणनीति और अभिकर्मक दक्षता और cytotoxicity के मूल्यांकन लागू करने के द्वारा मीर संशोधित hDFSCs की पीढ़ी के लिए एक विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं ।
वयस्क स्टेम सेल वर्तमान में ध्यान में कई अपक्षयी रोगों के उपचार के लिए कर रहे हैं । विशेष रूप से, अस्थि मज्जा (बी. एम.)-व्युत्पन्न स्टेम सेल, सहित टेम स्टेम सेल (HSCs) और MSCs, गहन नैदानिक जांच४७के तहत कर ?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को रॉस्टॉक यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर (८८९०१८) और सीलन फाउंडेशन (2016-11) के FORUN प्रोग्राम ने सपोर्ट किया था । इसके अलावा, P.M. और R.D. BMBF (वीआईपी + ००२४०) द्वारा समर्थित हैं ।
Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488 | Bio-Rad | MCA1557A488 | Clone SN6, monoclonal |
Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488 | Bio-Rad | MCA928A488 | monoclonal |
APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody | BD Biosciences | 559883 | Clone MAR4, monoclonal |
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 555751 | Clone MOPC-21, monoclonal |
PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody | BD Biosciences | 550257 | Clone AD2, monoclonal |
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 555749 | Clone MOPC-21, monoclonal |
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody | BD Biosciences | 339217 | Clone 104D2, monoclonal |
PE-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 557872 | Clone MOPC-21, monoclonal |
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody | BD Biosciences | 560531 | Clone G44-26, monoclonal |
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 558304 | Clone 27-35, monoclonal |
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90 Antibody | BD Biosciences | 561557 | Clone 5E10, monoclonal |
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 55095 | Clone MOPC-21, monoclonal |
V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody | BD Biosciences | 560777 | Clone HI30, monoclonal |
V500 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 560787 | Clone X40, monoclonal |
FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
UltraPure EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575-020 | 0.5M, pH 8.0 |
Steritop | Merck Millipore | SCGPT05RE | 0.22 µm, radio-sterilized, polyethersulfone |
BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
PFA | Merck Millipore | 1040051000 | |
Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit | R&D Systems | SC006 | |
RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 | Thermo Fisher Scientific | AM17120 | 5 nmol |
Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 | Thermo Fisher Scientific | AM17110 | 5nmol |
Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | polyclonal |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | polyclonal |
Mounting medium; Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057-20ML | histology mounting medium |
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope | Zeiss | ||
BD FACS LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
BD FACSDiva Software 6.1.2 | BD Biosciences | ||
ZEN2011 software | Zeiss | ||
Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%) | Biochrom | L2143 | in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+ |
Amine reactive dye; LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
PBS (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | pH: 7.4; w/o: Ca and Mg |
P-S-G (100x) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
Basal medium; Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11039021 | |
Antibiotic, ZellShield | Biochrom | W 13-0050 | |
FBS | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
Collagenase type I | Thermo Fisher Scientific | 17100017 | |
Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
Filter, Sterifix syringe filter 0.2 µm | Braun | 4099206 | |
50 mL conical centrifuge tube | Sarstedt | 62,547,254 | |
15 mL conical centrifuge tube | Sarstedt | 62,554,502 | |
Cell culture flask 75 cm2 | Sarstedt | 833,910,002 | |
Cell culture flask, 25 cm2 | Sarstedt | 833,911,002 | |
Freezing medium, Biofreeze | Biochrom | F 2270 | |
Cryotubes | Thermo Fisher Scientific | 377267 | 1.8 mL |
Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4 % |
Counting chamber | Paul Marienfeld | ||
Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001% | Mibe | ||
NaCl solution | Braun | 0.9 % | |
Vicryl satures, Vicryl rapide | Ethicon | 3 – 0 |