Summary
이 프로토콜 인간의 치과 여 포에서 추출한 치아 줄기 세포의 변이 유전 공학에 설명 합니다. 적용된 비 바이러스 성 수정 전략 치료 줄기 세포 제품의 개선 위한 기초 될 수 있습니다.
Abstract
날짜 하려면, 서로 다른 발달 단계에서 여러 줄기 세포 유형 퇴행 성 질환의 치료에 대 한 초점에 있습니다. 그러나, 초기 대규모 세포 죽음 및 낮은 치료 효과 등의 특정 양상 그들의 광범위 한 임상 번역 손상. 유전 공학 이식 전에 줄기 세포의 줄기 세포 치료 효과 최적화 하는 유망한 방법으로 등장. 그러나, 안전 하 고 효율적인 유전자 전달 시스템은 여전히 부족 합니다. 따라서, 적당 한 방법의 개발 줄기 세포 기반 요법에서 현재의 과제를 해결 하는 접근 방식을 제공할 수 있습니다.
현재 프로토콜은 그들의 비 바이러스 성 유전자 조작 뿐만 아니라 추출 및 인간의 치과 여 포 줄기 세포 (hDFSCs)의 특성을 설명합니다. 출생 후 치과 여 포는 높은 확산 잠재력을 보유 하는 성인 multipotent 줄기 세포를 수확 한 유망 하 고 쉽게 접근할 수 있는 소스로 발표 했다. 설명된 격리 절차 영향 을된 지혜의 이빨에서 hDFSCs 수확 간단 하 고 신뢰할 수 있는 메서드를 제공 합니다. 또한이 프로토콜 구성 고립 된 세포의 줄기 세포 특성을 정의 하는 방법. HDFSCs의 유전 공학에 대 한 최적화 된 양이온 지질에 기초를 둔 transfection 전략 세포 독성 효과 유발 하지 않고 사용 하면 매우 효율적인 예측에 관한 소개를 제공 됩니다. 이러한 작은 변환 레 귤 레이 터 제어 운명과 안정적인 게놈 통합의 위험 없이 줄기 세포의 행동 MicroRNAs 과도 셀 조작에 대 한 적합 한 후보자는. 따라서,이 프로토콜 최적화 그들의 치료 효능에 대 한 중요 한 될 수 있습니다 hDFSCs의 엔지니어링에 대 한 안전 하 고 효율적인 절차를 나타냅니다.
Introduction
인간의 치과 여 포 개발 치아1,2를 둘러싼 느슨한 ectomesenchymally 파생 결합 조직 이다. Osteoclastogenesis 및 골 치아 분화 과정에 대 한 조정 하는 기능 옆에 있는이 조직 특히 periodontium3,,45의 개발에 대 한 줄기와 조상 세포를 항만. 따라서, 치과 여 포는 인간 성인 줄기 세포6,7을 수확 하 대체 소스로 간주 됩니다.
여러 연구 결과 인간의 치과 여 포 줄기 세포 (hDFSCs) osteoblasts, 인 대 섬유 아 세포, cementoblasts8,,910 을 포함 한 치 주 혈통으로 차별화 할 수 있다 설명 했다 . 또한, 이러한 세포 mesenchymal stromal 세포 (MSCs)의 자기 갱신 용량, 플라스틱 준수, 표현의 특정 표면 마커를 포함 하 여 모든 특성에 맞게 표시 했다 (예:, CD73, CD90, CD105)으로 osteogenic 뿐만 adipogenic 및 chondrogenic 분화 잠재적인11,,1213. 다른 연구는 또한 hDFSCs2,,1415,16,,1718의 신경 감 별 법 잠재력을 계시 했다.
그들의 유망한 속성 및 쉬운 접근, hDFSCs 최근 조직 공학19,,2021관련 되었다. 첫 번째 연구는 치 주 뼈 생성에 DFSCs의 잠재력에 집중 하 고 치아 뿌리19,22,23,,2425,26, 27,,2829,30. HDFSCs의 neurogenic 기능의 지식, 신경 퇴행 성 질환에 대 한 잠재적인 치료로 그들의 응용 프로그램은 이후 조사31,,3233. HDFSCs 또한에 중요성을 얻고 있다 고 다른 조직 (예: 각 막 상피)34,35의 재생. HDFSC의 치료 잠재력은 그들의 paracrine 활동에 뿐만 아니라 그들의 직접적인 감 별 법 잠재력에만 근거 하지 않는다. 최근, hDFSCs 보였다 매트릭스 metalloproteinases (MMPs), 인슐린과 같은 성장 인자 (IGF), 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF), 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (bFGF) hepatocyte 성장 등 생리 활성 요인의 분 비 인수 (HGF), 신생, immunomodulation, 개장 하는 엑스트라 세포 매트릭스 및 회복 과정36에 대 한 중요 한 역할입니다.
그러나, 줄기 세포 치료의 광범위 한 임상 번역은 여전히 대규모 초기 세포 죽음 및 낮은 도움이 줄기 세포 효과37,38등 여러 문제에 의해 손상 된다. 유전 공학 이러한 과제를 해결 하기 위해 유망 전략을 제공 하 고 따라서 매우 줄기 세포38,,3940의 치료 효능을 강화할 수 있다. 변이 세포 조작, microRNAs (미르)는 적합 한 후보자, 이러한 작은 변환 레 귤 레이 터 제어 운명과 안정적인 게놈 통합41,42, 의 위험 없이 줄기 세포의 행동으로 43. 날짜, 여러 가지 유익한 미르 확인 된 줄기 세포 증식, 생존, 유도, paracrine 활동 뿐만 아니라 여러 계보44로 그들의 차별화 홍보. 예를 들어, 미르 133a 설계 MSCs 수정 되지 않은 MSCs45에 비해 향상 된 심장 기능의 결과로 infarcted 쥐 마음에 증가 생존 및 engraftment를 보여주었다. 마찬가지로, 미르-146a overexpressing MSCs 분 비 허 혈 성 조직46에서 향상 된 치료 효율 주도 차례에 VEGF의 더 높은 금액을 표시 했다.
이 원고는 선택적 추출 및 hDFSCs의 유전 공학에 대 한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 목적을 위해 우리 인간의 치과 여 포의 수확과 효소 소화 뿐만 아니라 hDFSCs의 후속 격리를 설명합니다. 고립 된 세포의 성격을 나타내기 위하여 MSC 속성의 확인에 대 한 중요 한 지침13세포 치료 대 한 국제 사회의 지침에 따라 포함 되었습니다. 또한, 우리는 양이온 지질에 기초를 둔 transfection 전략과 transfection 효율 및 세포 독성 평가 적용 하 여 미르 수정 hDFSCs의 생성에 대 한 자세한 설명을 제공 합니다.
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Protocol
HDFSCs 부의 구강 및 악 안 면 성형 수술으로 스톡 대학 의료 센터에서 제공 하는 추출 된 사랑니의 치과 여 포에서 격리 됩니다. 동 및 서 면된 승인 모든 환자에서 얻은 했다. 이 연구는로 스톡 대학 (권한 No. 2017-0158)의 로컬 윤리 위원회에 의해 허가 했다.
1입니다. hDFSCs의 격리
참고: 세균 오염을 방지 하기 위해, 사랑니 해야 하지 추출 하기 전에 발생 될
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필요한 솔루션의 준비
- 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 준비 / 페니실린-스-글루타민 (P-S-G) 솔루션: P-S-G 솔루션의 5 mL PBS의 495 mL 혼합. 4 ° c.에 50 mL의 aliquots를 저장
- HDFSC 문화 매체를 준비: 혼합 기저 매체의 445 mL 5 mL 항생제 에이전트와 소 태아 혈 청 (FBS) 50 mL와 함께. 4 ° c.에 게
- 콜라 종류 준비 솔루션 (30 mg/mL)을 재고: 콜라 유형 나 기저 매체의 10 mL에 1% 항생제 에이전트와 보충의 300 mg을 희석. 적극적으로 솔루션을 혼합. 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 필터링 합니다. 콜라의 500 µ L의 스토어 aliquots 유형 I-20 ° c.에 재고 솔루션
- Dispase II 재고 솔루션 (40 mg/mL) 준비: 1% 항생제 에이전트 보충 기저 매체의 10 mL에 Dispase II의 40 mg을 희석. 적극적으로 솔루션을 혼합. 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 필터링 합니다. -20 ° c.에 Dispase II 재고 솔루션의 500 µ L의 aliquots를 저장
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외과 절차
- 충분 한 양의 주사 (최대: 2 mL) 로컬 마 취의.
- 만들고 3 면 mucoperiosteal 플랩 발생 합니다. 언어 플랩 높이 필요 하지 않습니다.
- Periosteal 엘리베이터가 언어 측면을 보호 합니다.
- 부드럽게 밀 볼 및 원심 뼈와 함께 라운드 하드 금속 버.
- Periosteal 엘리베이터와 뿌리의 조직을 풉니다. 조심 스럽게 후부 (제 3-모 랄) 집게와 완전 한 치아 (세균)와 왕관을 철수 하 여 여 포 (및 뿌리) 제거.
- Debride 하 고 철저 하 게 NaCl 용액으로 소켓을 관개.
- Mucoperiosteal 플랩을 vicryl 봉합 ( 재료의 표참조) 바꿉니다.
- 구강에서 치아 뿌리를 제거 하 고 PBS/P-S-G 솔루션 50 mL의 약 수에 그들을 배치.
참고: 샘플 추가 처리까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
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치아 뿌리의 효소 소화
- 미리 따뜻한 hDFSC 문화 매체와 실내 온도 (RT) PBS/P-S-G 솔루션.
- 나 및 Dispase II 재고 솔루션 각 콜라 종류의 한 약 수를 녹여. 각 콜라의 500 µ L 타입 I과 기저 중간 포함 1% 항생제 에이전트의 4 ml Dispase II 재고 솔루션을 추가 하 여 3 mg/mL 콜라 종류의 소화 솔루션 어 4 mg/mL Dispase II 준비.
- 멸 균 페 트리 접시에 추출 된 뿌리를 놓고 추출 된 조직 씻어 PBS/P-S-G 솔루션의 10 mL를 추가 합니다. 이 세척 단계를 두 번 반복 합니다.
- 약 1 m m x 1 m m PBS/P-S-G 솔루션의 10 mL를 포함 하는 페 트리 접시 내 살 균 메스의 조각에 추출 된 뿌리를 말하다.
- 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브로 페 트리 접시에서 다진된 조직 및 PBS/P-S-G 솔루션을 전송. PBS/P-S-G 솔루션의 10 mL를 페 트리 접시를 세척 하 고 동일한 관으로 솔루션을 전송.
- 원뿔 원심 분리기 튜브 RT에서 353 x g 에서 10 분 원심 하 고 삭제는 상쾌한.
- 수송과 조직에 소화 솔루션의 5 mL를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 솔루션 및 조직. 떨고 인큐베이터에 2 h 37 ° C, 5% CO2 혼합물을 품 어.
- 원심 분리기에서 실시간 삭제는 상쾌한 10 분 353 x g 세포/조직 정지를 소화 하 고 다시 hDFSC 문화 매체의 6 mL에서 얻은 펠 릿을 일시 중단.
- 25 cm2 종자 세포 현 탁 액 문화 플라스 크 셀 하 고 37 ° C, 5% CO2 와 20% O2에 셀을 품 어.
참고: 조직을 완전히 소화 되지 않습니다 경우 나머지 조직 셀 뿐만 아니라 문화 플라스 크에 전송. - 중간 신중 하 게 24 시간 후 바꿀 셀 시드. 나중에 매체 confluency까지 3 일 마다 변경 합니다.
참고: HDFSCs는 플라스틱 부착 24 h 셀 시드 후 고 단순히 매체를 변경 하 여 비 부착 한 세포 및 혈액 구성 요소에서 분리 될 수 있다.
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셀 수확
- 미리 따뜻하게 hDFSC 문화 매체, PBS/P-S-G 솔루션 및 실시간 트립 신/Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션
- 문화 플라스 크에서 상쾌한 삭제 하 고 PBS/P-S-G 솔루션의 5 mL confluent 셀을 씻어.
- 문화 플라스 크를 1 mL의 트립 신/EDTA 솔루션을 추가 하 고 37 ° c.에 3 분 동안 품 어 문화 플라스 크를 hDFSC 문화 매체의 3 mL를 추가 하 여 소화 프로세스를 중지 합니다.
- 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 실시간 삭제는 상쾌한에 353 x g 에서 10 분 동안 현 탁 액을 원심 hDFSC 문화 매체의 적절 한 금액에 펠 릿을 다시 일시 중단.
- 셀: 부드럽게 Trypan 블루 솔루션의 10 µ L 10 µ L 세포 현 탁 액의 혼합. 세 실로 10 µ L을 적용 하 고 hDFSC 셀 금액 계산.
2입니다. hDFSCs의 특성
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Immunophenotyping
- 셀의 흐름 cytometric 분석에 대 한 준비
- 필요한 솔루션의 준비
- PBS/EDTA (2mm) 준비: 996 mL PBS의 EDTA (0.5 M)의 4 mL와 혼합.
- 얼룩 버퍼 준비: BSA의 5 g 995 mL PBS/EDTA (2 mM)의 혼합. 0.22 μ m 필터 단위를 사용 하 여 솔루션을 필터링 하 고 사용까지 4 ° C에서 저장 합니다.
- 준비 paraformaldehyde (PFA) 재고 솔루션 (4%): 4 g PFA PBS의 100 ml에서를 희석 하 고 열 80 ° c 솔루션 솔루션을 혼합 하 고 pH 값 7.3 조정. 약 수 사용까지 해당 금액 (1.5 mL)에-20 ° C에서 저장소 PFA 솔루션을 얻을.
주의: PFA 연기 독성 때문에, 통풍이 증기 두건에서 PFA 솔루션을 준비 합니다.
- 셀 (1.4)를 수확, 후 1.5 mL microcentrifuge 튜브 14 5 x 104 의 세포 샘플을 전송 합니다. 300 x g 4 ° c.에서 10 분 동안에 현 탁 액을 원심 폐기는 상쾌한.
참고: 오히려 회색된 룸에서 다음 작업을 수행 합니다. 달리 명시 하지 않는 한 셀 및 얼음에 시 약을 계속. - 다시 셀 얼룩 버퍼 (4 ° C)의 특정 금액을 일시 중단 하 고 FcR 시 (4 ° C)을 차단 하는 표 1에 표시 된 대로 추가 합니다.
- 표 1에 표시 된 대로 각 샘플의 안쪽에 다음 항 체를 추가: Allophycocyanin (APC) 마우스 안티 인간 CD29; APC 마우스 IgG1 κ isotype 제어; Peridinin-엽록소 단백질 (PerCP)-Cyanine5.5 마우스 안티 인간 CD44; PerCP-Cyanine5.5 마우스 IgG2b κ isotype 제어; V500 마우스 안티 인간 CD45; V500 마우스 IgG1 κ isotype 제어; Phycoerythrin (PE) 마우스 안티 인간 CD73; PE 마우스 IgG1 κ isotype 제어; PerCP-Cyanine5.5 마우스 안티 인간 CD90; PerCP-Cyanine5.5 마우스 IgG1 κ isotype 제어; 반대로 인간의 CD105 마우스: 알 렉 사 Fluor (AF) 488; IgG1 부정적인 제어 마우스: AF488; PE-Cyanine7 마우스 안티 인간 CD117; PE-Cyanine7 마우스 IgG1, κ isotype 제어 합니다. 각 샘플에 항 체를 추가한 후 항 체 아래로 회전 하 고 부드럽게 혼합. 4 ° c.에서 10 분에 대 한 솔루션을 품 어
- 1 mL의 PBS (4 ° C)를 추가 하 고 샘플을 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g에서 원심 폐기는 상쾌한.
- 다시 100 µ L의 PBS (4 ° C)에 있는 셀을 일시 중단 하 고 PFA (4%)의 33 µ L를 추가 합니다. 솔루션을 믹스와 흐름 cytometric 분석까지 얼음에 또는 4 ° C에서 저장 합니다.
- 필요한 솔루션의 준비
- 셀의 흐름 cytometric 측정
참고: 오히려 회색된 룸에서 다음 작업을 수행 합니다. 측정까지 얼음에 셀을 계속.- 표현의 표면 항 원 검사, 튜브 흐름 cytometric 측정을 위한 적합 한 샘플을 전송.
- 적어도 2 × 104 이벤트 흐름 cytometer를 사용 하 여 측정 합니다. 그림2에서와 같이 분석.
- 셀의 흐름 cytometric 분석에 대 한 준비
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HDFSCs multipotent 차별화 가능성
- 상업적으로 이용 가능한 인간 중간 엽 줄기 세포 기능 식별 키트를 사용 하 여 adipogenic, osteogenic 및 hDFSCs의 chondrogenic 감 별 법 잠재력을 확인 하. 적용 지방산 의무적인 단백질 4 (FABP4)의 얼룩에 대 한 당나귀 안티 염소 AF488 이차 항 체와 aggrecan osteocalcin의 얼룩에 대 한 당나귀 반대로 마우스 AF488 이차 항 체에 뿐만 아니라. 핵의 얼룩, 설치 매체와 함께 4', 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 사용 합니다.
참고: 현미경 분석에 대 한 부정적인 컨트롤로 기본 항 체 없이 샘플을 준비 합니다. - 레이저 공초점 현미경을 스캐닝 하 여 단백질의 표현 분석. 현미경 설정: 기름 침수;와 40 x 목표 (AF488)에 대 한 여기 레이저 488 nm 및 405 nm (DAPI)에 대 한.
- 상업적으로 이용 가능한 인간 중간 엽 줄기 세포 기능 식별 키트를 사용 하 여 adipogenic, osteogenic 및 hDFSCs의 chondrogenic 감 별 법 잠재력을 확인 하. 적용 지방산 의무적인 단백질 4 (FABP4)의 얼룩에 대 한 당나귀 안티 염소 AF488 이차 항 체와 aggrecan osteocalcin의 얼룩에 대 한 당나귀 반대로 마우스 AF488 이차 항 체에 뿐만 아니라. 핵의 얼룩, 설치 매체와 함께 4', 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 사용 합니다.
3입니다. hDFSCs의 transfection
- 셀 (1.4) 수확 후 24-잘 셀 문화 접시 transfection 이전 24 시간에 hDFSCs 씨.
참고: 잘 당 약 4 x 104 셀은 셀 밀도 시작. 세포는 transfection 요일에 ~ 80% 합류가 되어야만 합니다.
참고: 종자 하나 추가 셀 샘플 제어 흐름 cytometric 분석에 대 한. - Transfection 복합물의 준비
참고: 오염을 방지 하기 위해 RNases에서, 직접 transfection 단지 RNase 오염 제거 솔루션을 사용 하 여 준비 하기 전에 작업 영역을 청소. RNase 소재 및 솔루션을 사용 합니다.
참고: 오히려 회색된 룸에서 다음 작업을 수행 합니다.- 준비 하는 미르 재고 솔루션 (50 µ M): 다시 Cy3 표시 전조 미르 (5 nmol) 100 µ L nuclease 무료 물에서 중단. 약 수를 취득 해당 금액 (5 µ L) 미르 재고 솔루션 저장소-20 ° C에서 어둠 속에서 사용까지.
- 미르 (50 µ M 미르 재고 솔루션의 0.8 µ L) 감소 된 혈 청 매체의 66.7 µ L에서의 40 pmol 희석. 부드럽게 솔루션 혼합
- 감소 된 혈 청 매체의 66.7 µ L에서 양이온 지질에 기초를 둔 transfection 시 약의 0.67 µ L를 희석. 솔루션을 부드럽게 혼합 하 고 실시간에 5 분 동안 품 어
- 부 화, 후 미리 희석된 미르를 미리 희석된 transfection 시 약을 추가 합니다. 솔루션을 부드럽게 혼합 하 고 실시간에 15 분 동안 품 어
- 직접 셀에 문화 매체에 dropwise 준비 transfection 단지를 추가 합니다. 24 잘 셀 문화 접시와 락으로 부드럽게 혼합.
- 37 ° C, 5% CO2, 그리고 24 h에 대 한 20% O2 에 셀을 품 어.
4입니다. Transfection 분석
참고: 오히려 회색된 룸에서 다음 작업을 수행 합니다.
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세포 transfection 후 수확
참고: 모든 셀 솔루션 같은 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 하나의 샘플을 수집 합니다.- transfection, 후 24 h 각각 원심 분리기 튜브 샘플의 상쾌한을 수집 합니다.
- 셀 1 mL의 PBS로 세척, 각각 원심 분리기 관으로 PBS를 전송 및 추가 500 µ L 트립 신/EDTA (RT) 셀에. 37 ° c.에 3 분에 대 한 솔루션을 품 어
- 문화 매체 (RT)의 1 mL을 추가 하 여 셀을 각각 원심 분리기 관으로 전송 솔루션 trypsinization를 중지 합니다. 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기 세포
참고: 이 시간에서 달리 명시 하지 않는 한 셀 및 얼음에 시 약 유지.
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셀의 흐름 cytometric 분석에 대 한 준비
- 폐기는 상쾌한. 다시 셀 얼룩 버퍼 (4 ° C) 및 전송 셀 솔루션 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 100 µ L 일시 중단 합니다.
- 라이브와 죽은 세포를 구별 하기 위해 샘플에 아민 반응성 염료의 0.5 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 솔루션 및 4 ° c.에서 10 분 동안 품 어
- 셀을 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기 1 mL의 PBS (4 ° C)를 추가 폐기는 상쾌한.
- 다시 100 µ L의 PBS (4 ° C)에 있는 셀을 일시 중단 하 고 PFA (4%)의 33 µ L를 추가 합니다. 솔루션을 믹스와 흐름 cytometric 분석까지 얼음에 또는 4 ° C에서 저장 합니다.
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셀의 흐름 cytometric 측정
참고: 오히려 회색된 룸에서 다음 작업을 수행 합니다. 측정까지 얼음에 셀을 계속.- 흐름 cytometric 측정을 위한 적합 한 튜브 샘플을 전송 합니다.
- 세포 생존 능력 및 미르 통풍 관 효율 교류 cytometer를 사용 하 여 검사 합니다. 적어도 2 × 104 이벤트를 측정 합니다. 그림 4에 묘사 된 제어 전략을 사용 합니다.
참고: 부정적인 통제로 untransfected 세포를 사용 하 여 Cy3 긍정적인 셀 게이팅 정렬 하 고 계산 transfection에 기인한 세포 죽음.
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Representative Results
여기, 우리 인간의 치과 여 포 조직에서 hDFSCs을 수확 하는 상세한 격리 명령을 제시. 일상적인 수술 동안 치과 여 포의 쉬운 접근으로 성체 줄기 세포의 추출에 대 한 유망한 근원 이다.
격리 된 hDFSCs MSCs13의 정의 대 한 설명 하는 모든 특성을 보였다. 사실, 셀 플라스틱 부착 했다 아래 문화 상태를 설명 하 고 표시 구와 같은 형태 (그림 1). 흐름 cytometric 분석 hDFSCs 등 CD29, CD44, CD73, CD90 CD105, CD45 CD117 했다 (그림 2)에 결 석 하는 동안 특정 표면 항 원의 패널을 표현 밝혔다. 또한, adipogenic, osteogenic 및 특정 체 외에서 세포의 chondrogenic 감 별 법 잠재력 문화 조건 지방산 의무적인 단백질 4의 immunostaining (FABP4), osteocalcin aggrecan (그림 3)에 의해 확인 되었다.
설명된 양이온 지질에 기초를 둔 transfection 전략 hDFSCs ~ 100% 실행 가능한 셀 24 h 후 transfection (그림 4B)의 미르 통풍 관으로의 효율적인 과도 유전 수정 사용할 수 있습니다. 또한, transfected (그림 4A)와 untransfected (그림 4C) 샘플 부드러운 셀 처리 상태를 증명 하는 죽은 세포의 유사한 금액을 보였다.
그림 1: 대표적인 빛 hDFSCs의 현미경 사진. 셀 표시 표준 문화 조건 구와 같은 형태학.
그림 2: hDFSCs의 대표적인 흐름 cytometric immunophenotyping. 특정 세포 표면 마커 (파란색)에 대 한 얼룩 후 셀의 흐름 cytometric 분석. 해당 isotype 컨트롤 부정적인 컨트롤 (회색)으로 사용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: osteogenic adipogenic와 hDFSCs의 chondrogenic 감 별 법 잠재력의 대표 확인. 차별화, 후 adipocytes, osteocytes chondrocytes immunostaining (A) 지방산 의무적인 단백질 4의 (FABP4) (녹색), (B) osteocalcin (녹색) 및 (C) aggrecan (녹색)에 의해 확인 되었다. 핵 (파란색)와 DAPI 얼룩이 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: transfection의 분석에 대 한 전략을 게이팅 대표. 게이팅 (A) 세포 독성의 정량화에 대 한 사용 되는 전략의 도식 표현 (파란색: 죽은 세포)와 (B) Cy3 표시 된 미르 통풍 관 효율 (빨간색: Cy3+ 세포) 24 h 후 transfection. Untransfected 셀 (C,D) 제어로 사용 되었다.
맥 | FcR | 항 체 [µ L] | Isotype 컨트롤 [µ L] | |||||||||||||
샘플 | 버퍼 | 차단 | CD29 | CD44 | CD45 | CD73 | CD90 | CD105 | CD117 | APC | PerCP-Cy5.5 | V500 | PE | PerCP-Cy5.5 | AF488 | PE-Cy7 |
[µ l] | 시 [µ l] | APC | PerCP-Cy5.5 | V500 | PE | PerCP-Cy5.5 | AF488 | PE-Cy7 | IgG1 | IgG2b | IgG1 | IgG1 | IgG1 | IgG1 | IgG1 | |
1 | 30 | 10 | 10 | |||||||||||||
2 | 37.5 | 10 | 2.5 | |||||||||||||
3 | 37.5 | 10 | 2.5 | |||||||||||||
4 | 30 | 10 | 10 | |||||||||||||
5 | 35 | 10 | 5 | |||||||||||||
6 | 35 | 10 | 5 | |||||||||||||
7 | 37.5 | 10 | 2.5 | |||||||||||||
8 | 30 | 10 | 10 | |||||||||||||
9 | 30 | 10 | 10 | |||||||||||||
10 | 37.5 | 10 | 2.5 | |||||||||||||
11 | 30 | 10 | 10 | |||||||||||||
12 | 40 | 10 | 10 | |||||||||||||
13 | 30 | 10 | 5 | |||||||||||||
14 | 37.5 | 10 | 2.5 |
표 1: Pipetting immunophenotyping hDFSCs의 레이아웃.
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Discussion
성인 줄기 세포는 현재 여러 퇴행 성 질환의 치료에 대 한 집중에 있습니다. 특히, 뼈 골 수 (BM)-줄기 세포, 조 혈 줄기 세포 (HSCs)를 포함 하 여 파생 된 MSCs, 집중 임상 조사47그리고. 그러나, BM 수확 기부 사이트에 통증을 일으키는 침략 절차 이며48부작용 이어질 수 있습니다. 최근, 출생 후 치과 조직 줄기 세포에 대 한 소스를 쉽게 접근할 수 있는 고로 떠오르고 있다. 이 치과 줄기 세포는 모든 MSC 특성에 맞게 표시 되었고 BM 파생 된 줄기 세포49높은 확산 능력을 보여주었다. 여기, 우리는 추출, 특성화 및 hDFSCs의 엔지니어링에 대 한 상세한 프로토콜을 제시.
이 조직 일반적으로 추출 하 고 의료 폐기물19로 처분 설명된 격리 절차의 영향 을된 지혜의 이빨, 인간의 치과 낭에 개발 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 치과 펄프50,51, 치 주 인 대52, 낙 엽이 피부 박피53, 그리고 루트 꼭대기 시54를 포함 하 여 다른 치과 조직 치과 줄기의 추출에 이용 될 수 있다 셀입니다.
미르를 삽입 하 여 줄기 세포의 유전 공학 줄기 세포 기반 요법, 낮은 줄기 세포 생존43,55,,5657등 특정 어려움을 극복 하기 위해 새로운 전략 이다. 이 프로토콜은 상용 양이온 지질에 기초를 둔 transfection 시 약을 사용 하 여 hDFSCs로 합성 미르의 효율적인 도입에 대 한 중요 한 지침을 제시. 치료 시 약, 마약, 핵 산 등의 배달에 대 한 양이온 자주 공식의 응용 프로그램 수많은 임상 시험58,59조사 했다. 그러나, 양이온 리는 유전자 식59,,6061 에서 세포 막 또는 변경의 무결성에 예를 들어, 손상을 초래 하 여 잠재적으로 세포 독성 복용량 의존 방식 . 따라서, transfection에 의해 유도 된 세포에 독성 효과에 특별 한 주의 지불 한다.
특히, 표시 된 transfection 조건 효율성과 세포 독성에 대 한 hDFSCs의 유전 수정 미르 중재에 대 한 최적화 되었습니다 했습니다. 그럼에도 불구 하 고, 다른 연구 다른 세포 유형62,63, 에 추가 핵 산의, 포함 한 플라스 미드 DNA, mRNA, siRNA, 배달에 대 한이 transfection 시 약의 성공적인 응용 프로그램 시연 64 , 65 , 66 , 67 , 68.이 연구 결과 밝혀 이상적인 배달 조건 상당히 다양 하 고 각 셀 형식에 대해 정의 해야.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품의 젖은 기초 (2016-11)로 스톡 대학 의료 센터 (889018)와 FORUN 프로그램에 의해 지원 되었다. 또한, 오후 R.D. BMBF (VIP + 00240)에 의해 지원 됩니다.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488 | Bio-Rad | MCA1557A488 | Clone SN6, monoclonal |
Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488 | Bio-Rad | MCA928A488 | monoclonal |
APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody | BD Biosciences | 559883 | Clone MAR4, monoclonal |
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 555751 | Clone MOPC-21, monoclonal |
PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody | BD Biosciences | 550257 | Clone AD2, monoclonal |
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 555749 | Clone MOPC-21, monoclonal |
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody | BD Biosciences | 339217 | Clone 104D2, monoclonal |
PE-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 557872 | Clone MOPC-21, monoclonal |
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody | BD Biosciences | 560531 | Clone G44-26, monoclonal |
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 558304 | Clone 27-35, monoclonal |
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90 Antibody | BD Biosciences | 561557 | Clone 5E10, monoclonal |
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 55095 | Clone MOPC-21, monoclonal |
V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody | BD Biosciences | 560777 | Clone HI30, monoclonal |
V500 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 560787 | Clone X40, monoclonal |
FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
UltraPure EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575-020 | 0.5M, pH 8.0 |
Steritop | Merck Millipore | SCGPT05RE | 0.22 µm, radio-sterilized, polyethersulfone |
BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
PFA | Merck Millipore | 1040051000 | |
Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit | R&D Systems | SC006 | |
RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 | Thermo Fisher Scientific | AM17120 | 5 nmol |
Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 | Thermo Fisher Scientific | AM17110 | 5 nmol |
Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | polyclonal |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | polyclonal |
Mounting medium; Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057-20ML | histology mounting medium |
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope | Zeiss | ||
BD FACS LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
BD FACSDiva Software 6.1.2 | BD Biosciences | ||
ZEN2011 software | Zeiss | ||
Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%) | Biochrom | L2143 | in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+ |
Amine reactive dye; LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
PBS (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | pH: 7.4; w/o: Ca and Mg |
P-S-G (100x) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
Basal medium; Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11039021 | |
Antibiotic, ZellShield | Biochrom | W 13-0050 | |
FBS | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
Collagenase type I | Thermo Fisher Scientific | 17100017 | |
Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
Filter, Sterifix syringe filter 0.2 µm | Braun | 4099206 | |
50 mL conical centrifuge tube | Sarstedt | 62,547,254 | |
15 mL conical centrifuge tube | Sarstedt | 62,554,502 | |
Cell culture flask 75 cm2 | Sarstedt | 833,910,002 | |
Cell culture flask, 25 cm2 | Sarstedt | 833,911,002 | |
Freezing medium, Biofreeze | Biochrom | F 2270 | |
Cryotubes | Thermo Fisher Scientific | 377267 | 1.8 mL |
Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4 % |
Counting chamber | Paul Marienfeld | ||
Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001% | Mibe | ||
NaCl solution | Braun | 0.9 % | |
Vicryl satures, Vicryl rapide | Ethicon | 3 - 0 |
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