Her, beskriver vi en i situ hybridisering analyse, som gør det muligt for følsom og specifik påvisning af sekvenser så kort som 50 nukleotider med enkelt-nukleotid opløsning på én celle-niveau. Analysen, som kan udføres manuelt eller automatisk, kan aktivere visualisering af splice varianter, korte sekvenser og mutationer inden konteksten væv.
Fordi præcision medicin er stærkt afhængigt af den nøjagtige påvisning af biomarkører, er der et stigende behov for standardiseret og robuste teknologier, der måler RNA biomarkører i situ i klinisk prøvemateriale. Mens trummerum og binde assays som RNAseq og kvantitativ RT-PCR aktiverer meget følsomme gen expression målinger, de også kræver RNA udvinding og dermed forhindre værdifulde udtryk analyse i forbindelse morfologiske væv. Den i situ hybridisering (ISH) analysen beskrives her kan registrere RNA target sekvenser så kort som 50 nukleotider på enkelt-nukleotid opløsning og encellede plan. Denne analyse er et supplement til de tidligere udviklede kommercielle assay og gør det muligt for følsom og specifik i situ påvisning af splice varianter, korte mål og punktmutationer i vævet. I denne protokol, var sonder designet til at målrette unikke exon knudepunkter for to klinisk vigtige splice varianter, EGFRvIII og METΔ14. Påvisning af korte mål sekvenser blev demonstreret af specifik påvisning af CDR3 sekvenser af T-celle receptorer α og β i linjen Jurkat T-celle. Også vist er nytten af denne ISH assay for at skelne mellem RNA target sekvenser på enkelt-nukleotid opløsning (punktmutationer) gennem visualisering af EGFR L858R og KRAS G12A enkelt-nukleotid variationer i celle linjerne ved hjælp af automatiserede farvning platforme. Sammenfattende viser protokollen en specialiserede RNA ISH assay, der giver mulighed for påvisning af splice varianter, korte sekvenser og mutationer i stedet for manuel ydeevne og på automatiserede stainers.
Høj overførselshastighed transkriptom teknologier såsom microarrays og næste generations RNA sekventering (RNAseq) har eksponentielt forbedret opdagelse af RNA selektionsmarkører med diagnosticering, prognostiske og prædiktive klinisk værdi for forskellige sygdomme herunder kræft1,2. For at fremme brugen af disse biomarkører i præcision medicin, der er en høj behovet for standardiserede og robuste teknologier, der kan måle RNA biomarkører inden konteksten væv af kliniske prøver. Mens etableret bredt trummerum og binde assays som RNAseq og kvantitativ RT-PCR aktiverer meget følsomme gen expression målinger, kræves væv homogenisering og RNA isolering medfører tab i vivo celletype specificitet og morfologiske oplysninger3. Konventionelle i situ RNA påvisning metoder manglende følsomhed og specificitet kræves til pålideligt måle sjældne eller lav-udtrykker RNA biomarkører inden for væv sammenhæng4.
En kommerciel i situ hybridisering (ISH) assay (fx., RNAscope analysen) er en teknologi, der har taget fat på disse udfordringer og muliggør også yderst følsom og specifik visualisering af enkelt RNA molekyler større end 300 nukleotider morfologiske led væv. Denne type af assay bruger en unik oligonukleotid sonde design af ca 6-20 dobbelt-Z sonde par kombineret med en avanceret hybridisering-baseret signal forstærkning5.
Denne undersøgelse beskriver en specialiserede RNA ISH assay, BaseScope, supplerer den tidligere designede kommercielle teknologi, der kan registrere RNA target sekvenser så kort som 50 nukleotider på single nucleotid opløsning. Denne analyse er relevant til nøjagtig påvisning af exon vejkryds, korte mål sekvenser og punktmutationer i konteksten væv (tabel 1) bruger så lidt som en dobbelt-Z sonde par og løser indviklede kompleksiteten af transkriptom. Denne rapport viser komplet assay-protokollen og dens anvendelse i påvisning af splice varianter, CDR3 sekvenser for T-celle receptoren kloner, og enkelt-nukleotid mutationer i FFPE celle linjer og tumor væv.
I denne betænkning, blev roman ISH assay protokollen og dens ansøgninger drøftet i detaljer. Analysen giver mulighed for direkte visualisering af exon vejkryds, kort-mål og meget homologe sekvenser og punktmutationer i forbindelse med væv. Analysen er baseret på RNAscope teknologi5 og er derfor i stand til at enkelt molekyle påvisning. Men på grund af en avanceret forstærkning system, signalet kan påvises med sonder, der indeholder så lidt som en dobbelt-Z par eller med en target skabelon længde på kun 50 nukleotider. Fordi sonderne kan være så kort som en enkelt dobbelt-Z i længde, dette giver mulighed for påvisning af exon vejkryds, kort-mål og meget homologe sekvenser og punktmutationer (tabel 1).
For vellykket præstation af analysen er der flere tekniske anbefalinger. Først, væv bør fastsættes i frisk 10% neutral-buffered formalin (NBF) ved stuetemperatur for 16 – 32 h10. Underfixation ( 32 h) vil forringe ydeevnen af analysen og kan kræve yderligere optimering. For det andet for at sikre optimal kontrol af temperatur og fugtighed, som er nødvendige for robust sonde hybridisering og signal forstærkning, bør diasset processing system og hybridisering ovn anvendes til protokollen trin 2.3 til 5 (protease forbehandling, sonde hybridisering, signal forstærkning, og signal detektion). Tredje, overskydende resterende buffere skal være ordentligt dekanterede før hvert trin i hele protokollen (men ikke så meget, at sektionerne væv tørre ud). Hvis diasene tørre ud, vil betydelige ikke-specifikke signal udvikle. Fjerde, alt efter vævstype, forbehandling optimering kan være nødvendigt. Bruger den forkerte protease eller udfører for en suboptimal tidsrum kan resultere i under – eller slut – digestion og påvirker negativt signalet. Endelig er det vigtigt at kører altid positive og negative kontroller med test-sonder. Negativ kontrol sonder sikre at der ikke er nogen baggrund signal, og positiv kontrol sonder sikre, at analysen har været gjort korrekt og at RNA kvalitet i stikprøven er optimal for at fortolke testresultater sonde. Hvis der ikke er noget signal med positiv kontrol sonde, så RNA kvalitet i stikprøven er sandsynligt suboptimal og et signal kan ikke ses med test sonden.
Ud over de manuelle assay blev evnen til at udføre analysen på automatiserede stainers også vist (figur 6). Denne automatiserede ISH analyse giver et højt signal / støj-forhold og er gældende for de samme anvendelser som vist i tabel 1; men fordelene ved en automatiseret analyse omfatter standardisering af analysen betingelser, minimering af Inter bruger variabilitet og hands-on tid, og ydelse til high throughput screening af vævsprøver på en pålidelig måde.
Mens Immunhistokemi (IHC) og qRT-PCR giver mulighed for påvisning af splice varianter (især EGFRvIII), i FFPE kliniske prøver, disse teknikker kan mangle de nødvendige specificitet og giver ikke indblik i den rumlige opløsning af splice variant, udtryk, henholdsvis11,12. En vigtig fordel af analysen i denne protokol er dens yderst følsom og specifik visualisering af splice knudepunkter samtidig bevare forbindelse morfologiske væv. Her, blev den assay evne til præcist målrettede unikke exon knudepunkter for flere splice varianter, herunder EGFRvIII og METΔ14, demonstreret (tallene 3 og 6). Derudover har analysen vist sig at opdage splice variant AR-V7 i prostata cancer, flere isoformer af ErbB4 i hjernen, og bekræftelse af knockout af cirkulært RNA Cdr1as i mus hjernen3,13,14.
Kort mål sekvens afsløring af dette ISH assay giver mulighed for visualisering af RNA sekvenser så kort som 50 nukleotider i længde, som påvist ved påvisning af CDR3 sekvenser stammer fra Jurkat celler (figur 3). Analysen kan også registrere gensekvenser, der er stærkt homologe til andre familiemedlemmer eller arter, som det fremgår af Revêchon mfl., der anvendes korte mål assay til påvisning af menneskelige progerin udtrykt i mus subkutane hvidt fedtvæv15. Derudover kan små nucleolar RNA (snoRNA), CRISPR-medieret gen redigering og forløber-mikroRNA være fundne i situ kort mål assay. Mere nylig, Fu et al. kombineret denne ISH assay med IHC at identificere præcis celler i nethinden udtryk for pre-miRNA mir125b16.
Mutation profilering i tumorer er kritisk for at studere progression af tumorer og udvikle målrettede behandlinger. Mens mutation profilanalyse kan opnås via høj overførselshastighed sekventering, kan denne teknologi fuldt adresse intratumoral heterogenitet eller link genetiske ændringer med cellulære morfologi17,18. Påvisning af punktmutationer ved hjælp af denne ISH assay tillader sondring af RNA target sekvenser med en enkelt-base opløsning, som validerede ved påvisning af EGFR L858R og KRAS G12A enkelt nucleotid variationer i cellelinjer (figur 5). Derudover bruges Baker et al. punkt mutation analysen for at målrette flere mutationer i BRAF, KRAS og PIK3CA onkogener i kolorektal cancer18. De var i stand til at identificere og kortlægge rumligt sjældne mutant subclones af tumorceller, i sidste ende viser hvordan de bidrager til intra-tumor heterogenitet.
Sammenfattende er der udarbejdet en specialiserede RNA ISH assay. Denne metode giver mulighed for påvisning af splice varianter, korte sekvenser og mutationer i situ. Det er følsomme, specifikke, målbare og smidig ydeevne både af manuelle metoder og på automatiserede stainers.
The authors have nothing to disclose.
HybEZ Oven (110 or 220 VAC) or HybEZ II Oven (110 or 220V) | ACD | 310010 or 310013 (HybEZ™), 321710 or 321720 (HybEZ™ II) | |
HybEZ Humidity Control Tray (with lid) | ACD | 310012 | |
ACD EZ-Batch Slide Rack (20 slide capacity) 1 rack 310017 | ACD | 310017 | |
HybEZ Humidifying Paper | ACD | 310015 | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen (required) | Vector Laboratory | H-4000 | |
SuperFrost Plus Slides (required) | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
10% neutral-buffered formalin (NBF) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Paraffin wax | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Microtome | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Gill’s Hematoxylin I | American Master Tech Scientific/MLS | HXGHE1LT | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Xylene | Fisher Scientific/MLS | X3P-1GAL | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Tissue-Tek Vertical 24 Slide Rack | American Master Tech Scientific/MLS | LWSRA24 | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Tissue-Tek Staining Dishes | American Master Tech Scientific/MLS | LWT4457EA | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Tissue-Tek Clearing Agent Dishes, xylene resistant | American Master Tech Scientific/MLS | LWT4456EA | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
100% alcohol (EtOH) | American Master Tech Scientific/MLS | ALREACS | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
VectaMount Permanent Mounting Medium (required) | Vector Labs | H-5000 | |
Cover Glass, 24 x 50 mm | Fisher Scientific/MLS | 12-545-F | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Ammonium hydroxide, 28–30% | Sigma-Aldrich/MLS | 320145-500mL | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Carboy (>3L) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Oster Steamer Model 5712, Black and Decker Steamer HS3000, or the Braun Multiquick FS 20 Steamer | / | / | |
Digital thermometer | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Water bath or incubator, capable of holding temperature at 40 +/– 1°C | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Pipettors and tips, 1–1000 μL | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Distilled water | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Tubes (various sizes) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Fume hood | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Graduated cylinder | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Parafilm | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Paper towel or absorbent paper | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Microcentrifuge | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Microscope and accessories | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Drying oven, capable of holding temperature at 60 +/– 1°C | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Formaldehyde | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Histogel | Fisher Scientific/MLS | 22-110-678 | |
BaseScope Reagent Kit – RED | Advanced Cell Diagnostics | 322900 | |
BaseScope Hs-EGFR-E1E2 | Advanced Cell Diagnostics | 701701 | |
BaseScope Hs-EGFR-E1E8 | Advanced Cell Diagnostics | 701711 | |
BaseScope Hs-EGFR-E7E8 | Advanced Cell Diagnostics | 701721 | |
BaseScope Hs-EGFR-E8E9 | Advanced Cell Diagnostics | 701731 | |
BaseScope Hs-MET-E14E15 | Advanced Cell Diagnostics | 701811 | |
BaseScope Hs-MET-E13E15 | Advanced Cell Diagnostics | 701801 | |
BaseScope Hs-KRAS-G12A | Advanced Cell Diagnostics | 705491 | |
BaseScope Hs-KRAS-G12-nt35WT | Advanced Cell Diagnostics | 705531 | |
BaseScope Hs-EGFR-L858R | Advanced Cell Diagnostics | 705451 | |
BaseScope Hs-EGFR-L858WT | Advanced Cell Diagnostics | 705461 | |
BaseScope Control Probe Pack Human | Advanced Cell Diagnostics | 322975 |