Hier beschreiben wir einen in Situ Hybridisierung Test sensitiver und spezifischer Nachweis von Sequenzen so kurz wie 50 Nukleotide mit Einzel-Nukleotid-Auflösung auf die einzelne Zelle Ebene ermöglicht. Assays, die manuell oder automatisch ausgeführt werden kann, kann Visualisierung von Splice-Varianten, kurze Sequenzen und Mutationen im Zusammenhang mit Gewebe ermöglichen.
Da präzisionsmedizin stark abhängig von der genauen Nachweis von Biomarkern ist, gibt es ein zunehmender Bedarf an standardisierten und robuste Technologien, die RNA Biomarker in Situ in klinischen Proben zu messen. Während die Grind-Bind-Assays wie RNAseq und quantitative RT-PCR ermöglichen hochsensiblen Gen Ausdruck Messungen, sie erfordern auch RNA-Extraktion und verhindern somit wertvolle Expressionsanalyse morphologische Gewebe im Rahmen. Die in Situ Hybridisierung (ISH)-Assay hier beschriebenen erkennt RNA Zielsequenzen 50 Nukleotide auf Einzel-Nukleotid-Auflösung und die einzelligen Ebene möglichst kurz. Dieser Test ist eine Ergänzung zu den bisher entwickelten kommerziellen Assay und ermöglicht die Sensitivität und Spezifität in Situ Detektion der Splice-Varianten, kurze Ziele und Punktmutationen im Gewebe. In diesem Protokoll wurden Sonden entwickelt, um einzigartige Exon Kreuzungen für zwei klinisch relevanten Splice-Varianten, EGFRvIII und METΔ14 Ziel. Die Erkennung von kurzen Zielsequenzen zeigte sich durch den spezifischen Nachweis des CDR3 Sequenzen von T-Zell-Rezeptoren-α und β in der Jurkat T-Zell-Linie. Auch ist das Dienstprogramm des ISH Assays für die Unterscheidung von RNA-Zielsequenzen bei Einzel-Nukleotid-Auflösung (Punktmutationen) durch die Visualisierung der EGFR L858R und KRAS G12A Einzel-Nukleotid-Variationen in Zelllinien mit automatisierten Färbung Plattformen. Zusammenfassend zeigt das Protokoll einen spezialisierten RNA ISH-Assay, der es die Erkennung von Splice-Varianten, kurze Sequenzen und Mutationen in Situ für manuelle und automatische freigesprochen ermöglicht.
Transkriptomischen von Hochdurchsatz-Technologien wie Microarrays und Next-Gen-RNA-Sequenzierung (RNAseq) haben die Entdeckung der RNA-Biomarker mit diagnostischen, prognostischen und prädiktiven klinischen Wert für verschiedene Krankheiten einschließlich exponentiell verbessert. Krebs1,2. Um den Einsatz dieser Biomarker in der präzisionsmedizin zu fördern, gibt es ein hohen Bedarf an standardisierten und robuste Technologien, die RNA Biomarker die Gewebe im Rahmen von klinischen Proben messen kann. Während allgemein etabliert, Grind und Bind-Assays wie RNAseq und quantitative RT-PCR ermöglichen hochsensiblen Gen Ausdruck Messungen, die erforderlichen Gewebe Homogenisierung und RNA Isolierung bedeuten den Verlust der in Vivo Zelltyp Spezifität und morphologische Informationen3. Konventionelle in Situ RNA Erkennung Methoden fehlen die Sensitivität und Spezifität erforderlich, um seltene oder niedrigen exprimierenden RNA Biomarker innerhalb der Gewebe Kontext4zuverlässig messen.
Eine kommerzielle in Situ -Hybridisierung (ISH)-Assay (zB., die RNAscope-Assay) ist eine Technologie, die diese in Angriff genommen hat Herausforderungen und ermöglicht auch die hoch empfindliche und spezifische Visualisierung der einzelnen RNA-Moleküle, die größer als 300 Nukleotide im Gewebe morphologischen Kontext. Diese Art von Test verwendet eine einzigartige Oligonukleotid Sonde Design von ca. 6 – 20 Doppel-Z-Sonde Paaren kombiniert mit einer erweiterten Hybridisierung-basierte Signal Verstärkung5.
Diese Studie beschreibt einen speziellen RNA-ISH Assay, BaseScope, ergänzend zu der zuvor entworfenen kommerzielle Technologie, die RNA-Zielsequenzen so kurz wie 50 Nukleotide bei Einzel-Nukleotid-Auflösung erkennen kann. Dieser Test befasst sich mit der komplizierten Komplexität des transkriptoms und gilt für die präzise Erkennung von Exon Kreuzungen, kurze Zielsequenzen und Punktmutationen im Gewebe Kontext (Tabelle 1) mit so wenig wie ein Doppel-Z-Sonde. Dieser Bericht zeigt das komplette Test-Protokoll und seine Verwendung bei der Erkennung von Splice-Varianten, CDR3-Sequenzen für T-Zell-Rezeptor-Klone, und Einzel-Nukleotid-Mutationen im FFPE Zell-Linien und Tumorgewebe.
In diesem Bericht wurden die neuartigen ISH Assay-Protokoll und seine Anwendungen im Detail besprochen. Der Test ermöglicht die direkte Visualisierung der Exon-Kreuzungen, kurz-Ziel und hochgradig homologe Sequenzen und Punktmutationen im Zusammenhang mit Gewebe. Der Test basiert auf RNAscope Technologie5 und ist daher in der Lage der Einzelmolekül-Erkennung. Jedoch kann durch eine erweiterte Verstärkersystem, das Signal mit Sonden mit so wenig wie ein Doppel-Z-Paar oder mit einer Ziel-Vorlage-Länge von nur 50 Nukleotide erkannt werden. Da die Sonden so kurz wie ein einziges Doppel-Z Länge sein können, können zum Nachweis von Exon Kreuzungen, kurz-Ziel und hochgradig homologe Sequenzen und Punktmutationen (Tabelle 1).
Für eine erfolgreiche Leistung des Assays gibt es mehrere technische Empfehlungen. Zuerst Gewebe in frischen 10 % Neutral gepufferte Formalin (NBF) bei Raumtemperatur für 16-32 h10festzusetzen. Underfixation ( 32 h) wird die Leistung des Assays beeinträchtigen und möglicherweise zusätzliche Optimierung. Zweitens sollte dafür optimale Steuerung von Temperatur und Luftfeuchtigkeit, die für robuste Sonde Hybridisierung und Signal-Verstärkung erforderlich sind, die Folie Verarbeitung System und Hybridisierung Ofen für Protokoll Schritte 2,3 bis 5 (Protease Vorbehandlung, Sonde verwendet werden Hybridisierung, Signalverstärkung und Signalerkennung). Drittens: überschüssige Rest Puffer sollte vor jedem Schritt im gesamten Protokoll richtig dekantiert (aber nicht so sehr, dass die Gewebeschnitte Austrocknen). Wenn die Folien austrocknen, werden erhebliches unspezifisches Signal entwickeln. Viertens kann je nach Gewebetyp, Vorbehandlung Optimierung erforderlich. Verwendung der falschen Protease oder eine suboptimale lang durchführen kann in unter – oder over – digestion und wirken sich negativ auf das Signal. Zu guter Letzt ist es wichtig, immer positive und negative Kontrollen mit den Prüfspitzen laufen. Negativkontrolle Sonden sicherzustellen, dass keine Hintergrundsignal vorhanden ist, und Positivkontrolle Sonden stellen Sie sicher, dass der Test korrekt durchgeführt wurde und die RNA-Qualität in der Probe optimal ist für die Interpretation der Testergebnisse Sonde. Wenn es kein Signal mit der Positivkontrolle Sonde, dann die RNA-Qualität in der Stichprobe dürfte suboptimal und ein Signal nicht mit der Prüfspitze gesehen werden kann.
Neben der manuellen Test wurde die Leistungsfähigkeit des Tests auf automatisierte freigesprochen auch gezeigt (Abbildung 6). Dieser automatisierte ISH-Assay ergibt sich ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis und eignet sich für die gleichen Anwendungen wie in Tabelle 1dargestellt; jedoch Vorteile einer automatisierten Tests gehören Standardisierung der Assay-Bedingungen, Minimierung von Inter Benutzer Variabilität und Hands-on-Zeit und Zulage für Hochdurchsatz-Screening von Gewebeproben auf zuverlässige Weise.
Während Immunhistochemie (IHC) und qRT-PCR zur Detektion von Splice-Varianten (besonders EGFRvIII), in klinischen Proben FFPE erlauben, diese Techniken können nicht über die erforderliche Spezifität und bieten keinen Einblick in die räumliche Auflösung des spleißes Variant Ausdruck, bzw.11,12. Ein entscheidender Vorteil des Assays in diesem Protokoll ist seine sehr empfindlich und spezifisch Visualisierung der Spleiß Kreuzungen unter Beibehaltung der morphologischen Gewebe-Kontext. Hier war der Assay Fähigkeit, einzigartige Exon Kreuzungen für mehrere Splice-Varianten, einschließlich EGFRvIII und METΔ14, präzise Ziel gezeigt (Abbildungen 3 und 6). Darüber hinaus hat der Test gezeigt, spleißvariante AR-V7 in Prostata-Krebs, mehrere Isoformen von ErbB4 im Gehirn und Bestätigung der Ko von kreisförmigen RNA-Cdr1as in der Maus Gehirn3,13,14erkennen.
Kurze Sequenz Zielerfassung von ISH Assays kann zur Visualisierung der RNA-Sequenzen so kurz wie 50 Nukleotide in der Länge, wie gezeigt durch den Nachweis des CDR3 Sequenzen Jurkat Zellen (Abbildung 3) abgeleitet. Der Test kann auch erkennen, Gensequenzen, die höchst Homolog zu anderen Familienmitgliedern oder Arten, dargestellt durch Revêchon Et Al., wer den kurzen Ziel-Assay verwendet, um menschliche Progerin ausgedrückt in Maus subkutane weißen Fettgewebe15erkennen. Darüber hinaus können kleine Nukleolus RNA (SnoRNA), CRISPR-vermittelten gen bearbeiten und Vorläufer-RNA erkannten in Situ mit der kurzen Ziel-Test sein. In jüngerer Zeit, kombiniert Fu Et Al. ISH Assays mit IHC, präzise Zellen in der Netzhaut, die mit dem Ausdruck der Pre-MiRNA mir125b16zu identifizieren.
Mutation, die Profilerstellung in Tumoren ist von entscheidender Bedeutung für das Studium der Progression von Tumoren und für gezielte Therapien zu entwickeln. Während Mutation Profilierung durch Hochdurchsatz-Sequenzierung erreicht werden kann, kann nicht diese Technologie intratumorale Heterogenität oder Link genetische Veränderungen mit zellulären Morphologie17,18vollständig behandelt. Der Nachweis von Punktmutationen mit dieser ISH-Assay kann zur Unterscheidung von RNA-Ziel-Sequenzen mit einer Single-Base-Auflösung als validiert durch den Nachweis des EGFR L858R und KRAS G12A Einzel-Nukleotid-Variationen in Zelllinien (Abbildung 5). Darüber hinaus verwendet Baker Et Al. die Punktmutation Assay mehrere Mutationen im BRAF, KRAS und PIK3CA Onkogene in colorectal Krebs18. Identifizieren und räumlich Karte selten mutierten Subclones von Tumorzellen, letztlich zeigen, wie sie zur Intra-Tumor Heterogenität beitragen konnten.
Zusammenfassend lässt sich sagen wurde eine spezielle RNA-ISH-Assay entwickelt. Diese Methodik ermöglicht die Erkennung von Splice-Varianten, kurze Sequenzen und Mutationen in Situ. Es ist sensibel, konkrete, quantifizierbare und anpassungsfähig Leistung durch manuellen Methoden und auf automatisierten freigesprochen.
The authors have nothing to disclose.
HybEZ Oven (110 or 220 VAC) or HybEZ II Oven (110 or 220V) | ACD | 310010 or 310013 (HybEZ™), 321710 or 321720 (HybEZ™ II) | |
HybEZ Humidity Control Tray (with lid) | ACD | 310012 | |
ACD EZ-Batch Slide Rack (20 slide capacity) 1 rack 310017 | ACD | 310017 | |
HybEZ Humidifying Paper | ACD | 310015 | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen (required) | Vector Laboratory | H-4000 | |
SuperFrost Plus Slides (required) | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
10% neutral-buffered formalin (NBF) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Paraffin wax | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Microtome | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Gill’s Hematoxylin I | American Master Tech Scientific/MLS | HXGHE1LT | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Xylene | Fisher Scientific/MLS | X3P-1GAL | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Tissue-Tek Vertical 24 Slide Rack | American Master Tech Scientific/MLS | LWSRA24 | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Tissue-Tek Staining Dishes | American Master Tech Scientific/MLS | LWT4457EA | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Tissue-Tek Clearing Agent Dishes, xylene resistant | American Master Tech Scientific/MLS | LWT4456EA | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
100% alcohol (EtOH) | American Master Tech Scientific/MLS | ALREACS | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
VectaMount Permanent Mounting Medium (required) | Vector Labs | H-5000 | |
Cover Glass, 24 x 50 mm | Fisher Scientific/MLS | 12-545-F | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Ammonium hydroxide, 28–30% | Sigma-Aldrich/MLS | 320145-500mL | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Carboy (>3L) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Oster Steamer Model 5712, Black and Decker Steamer HS3000, or the Braun Multiquick FS 20 Steamer | / | / | |
Digital thermometer | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Water bath or incubator, capable of holding temperature at 40 +/– 1°C | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Pipettors and tips, 1–1000 μL | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Distilled water | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Tubes (various sizes) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Fume hood | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Graduated cylinder | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Parafilm | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Paper towel or absorbent paper | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Microcentrifuge | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Microscope and accessories | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Drying oven, capable of holding temperature at 60 +/– 1°C | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Formaldehyde | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Histogel | Fisher Scientific/MLS | 22-110-678 | |
BaseScope Reagent Kit – RED | Advanced Cell Diagnostics | 322900 | |
BaseScope Hs-EGFR-E1E2 | Advanced Cell Diagnostics | 701701 | |
BaseScope Hs-EGFR-E1E8 | Advanced Cell Diagnostics | 701711 | |
BaseScope Hs-EGFR-E7E8 | Advanced Cell Diagnostics | 701721 | |
BaseScope Hs-EGFR-E8E9 | Advanced Cell Diagnostics | 701731 | |
BaseScope Hs-MET-E14E15 | Advanced Cell Diagnostics | 701811 | |
BaseScope Hs-MET-E13E15 | Advanced Cell Diagnostics | 701801 | |
BaseScope Hs-KRAS-G12A | Advanced Cell Diagnostics | 705491 | |
BaseScope Hs-KRAS-G12-nt35WT | Advanced Cell Diagnostics | 705531 | |
BaseScope Hs-EGFR-L858R | Advanced Cell Diagnostics | 705451 | |
BaseScope Hs-EGFR-L858WT | Advanced Cell Diagnostics | 705461 | |
BaseScope Control Probe Pack Human | Advanced Cell Diagnostics | 322975 |