Her beskriver vi i situ hybridisering analysen som gir sensitive og bestemt påvisning av sekvenser idet kort idet 50 nukleotider med enkelt-nukleotid oppløsning på encellede nivå. Analysen, som kan utføres automatisk eller manuelt, kan Aktiver visualisering av skjøte varianter, korte sekvenser og mutasjoner vev kontekst.
Presisjon medisin er svært avhengig av nøyaktig påvisning av biomarkers, er det et økende behov for standardisert og robust teknologi som måler RNA biomarkers i situ i klinisk eksemplarer. Mens grind-og-binde analyser som RNAseq og kvantitative RT PCR aktiverer svært følsom gene expression målinger, de også kreve RNA utvinning og dermed hindre verdifulle uttrykk analyse morfologiske vev kontekst. I situ hybridisering (ISH) analysen beskrevet her kan oppdage RNA målet sekvenser idet kort idet 50 nukleotider i enkelt-nukleotid oppløsning og på encellede nivå. Denne analysen er utfyllende til tidligere utviklet kommersielle analysen og gir sensitive og bestemt i situ påvisning av skjøte varianter, kort mål og punkt mutasjoner i vevet. I denne protokollen, var sonder designet for å målrette unike ekson veikryss for to klinisk viktige skjøte-varianter, EGFRvIII og METΔ14. Gjenkjenning av kort mål sekvenser ble demonstrert av bestemte påvisning av CDR3 sekvenser av T-celle reseptorer α og β i Jurkat T-celle linje. Også vist er nytten av denne ISH analysen for æren av RNA målet sekvenser med enkelt-nukleotid oppløsning (punkt mutasjoner) gjennom visualisering av EGFR L858R og KRAS G12A enkelt-nukleotid variasjoner i linjer med automatisert farging plattformer. Oppsummert viser protokollen en spesialisert RNA ISH analysen som gjør påvisning av skjøte varianter, korte sekvenser og mutasjoner i situ for manuell ytelse og automatisert stainers.
Høy gjennomstrømming transcriptomic teknologier som microarrays og neste generasjons RNA sekvensering (RNAseq) har eksponentielt forbedret oppdagelsen av RNA biomarkers med diagnostiske prognostiske og prediktiv klinisk verdi for ulike sykdommer, inkludert kreft1,2. For å fremme bruk av disse biomarkers i presisjon medisin, det er en høy behovet for standardisert og robust teknologier som kan måle RNA biomarkers vev kontekst av klinisk prøver. Mens etablert grind-og-binde analyser som RNAseq og kvantitative RT PCR aktiverer svært følsom gene expression målinger, den nødvendige vev homogenisering og RNA isolasjon innebærer tap av i vivo celle-type spesifisitet og morfologiske informasjon3. Konvensjonelle i situ RNA gjenkjenning metoder mangler sensitivitet og spesifisitet nødvendig å måle pålitelig sjeldne eller lav-uttrykke RNA biomarkers i vev sammenheng4.
En kommersiell i situ hybridisering (ISH) analysen (f.eks., RNAscope analysen) er en teknologi som har taklet disse utfordringene og kan også svært sensitive og spesifikke visualisering av enkelt RNA molekyler større enn 300 nukleotider vev morfologiske kontekst. Denne typen analysen bruker en unik oligonucleotide sonde ca 6-20 dobbel-Z sonde par kombinert med en avansert hybridisering-baserte signal forsterkning5.
Denne studien beskriver en spesialisert RNA ISH analysen, BaseScope, utfyllende til tidligere designet kommersielle teknologi som kan oppdage RNA målet sekvenser idet kort idet 50 nukleotider single nukleotid oppløsning. Denne analysen adresser intrikate kompleksiteten i transcriptome og gjelder for nøyaktig påvisning av ekson veikryss, kort mål sekvenser og punkt mutasjoner i vev sammenheng (tabell 1) som to dobbel-Z sonde par. Denne rapporten viser komplett analysen protokollen og dens bruk i deteksjon av skjøte varianter, CDR3 sekvenser for T-celle reseptor kloner, og enkelt-nukleotid mutasjoner i FFPE cellen linjer og tumor vev.
I denne rapporten ble romanen ISH analysen protokollen og tilhørende programmer diskutert i detalj. Analysen gir direkte visualisering av ekson veikryss, kort-mål og svært homologe sekvenser og punkt mutasjoner i vev sammenheng. Analysen er basert på RNAscope teknologi5 og er derfor i stand til å enkelt molekyl gjenkjenning. Men på grunn av en avansert høytaleranlegg, kan signalet oppdages med probes som inneholder som en dobbel-Z par eller en mål mal lengde på bare 50 nukleotider. Fordi sonder kan være så kort som et enkelt dobbelt-Z i lengde, gir dette gjenkjenning av ekson veikryss, kort-mål og svært homologe sekvenser og punkt mutasjoner (tabell 1).
Vellykket forestilling av analysen er det flere tekniske anbefalinger. Først skal vev være fast i frisk 10% nøytrale fullbufrede formalin (NBF) ved romtemperatur for 16 – 32 h10. Underfixation ( 32 h) vil svekke ytelsen til analysen og kan kreve ytterligere optimalisering. Andre, for å sikre optimal kontroll av temperatur og fuktighet, som er nødvendig for robust sonde hybridisering og signal forsterkning, lysbildet behandling system og hybridisering ovnen skal brukes for protokollen trinn 2.3 til 5 (protease forbehandling, sonde hybridisering, signalforsterkning og signalgjenkjenning). Tredje, overflødig gjenværende buffere bør være riktig decanted før hvert trinn gjennom protokollen (men ikke så mye at delene vev tørke ut). Hvis lysbildene tørke ut, utvikler betydelig uspesifisert signal. Fjerde avhengig vev, kan forbehandling optimalisering være nødvendig. Bruker det galt protease eller utfører for suboptimal lengre tid kan resultere i under – eller over – digestion og vil negativt påvirke signalet. Endelig er det viktig å alltid løpe positive og negative kontroller med test sonder. Negativ kontroll sonder sikre at det ingen bakgrunn signal, og positiv kontroll sonder sikre at analysen er gjort riktig og at RNA kvaliteten i utvalget er optimal for å tolke testresultatene sonde. Hvis det er ikke noe signal med positiv kontroll proben, så RNA kvaliteten i utvalget er sannsynlig suboptimal et signal kan ikke ses med test sonden.
I tillegg til manuell analysen var muligheten til å utføre analysen på automatiserte stainers også demonstrert (figur 6). Denne automatiserte ISH analysen gir en høy signal-til-støy-forhold og gjelder for de samme programmene som vist i tabell 1. men fordelene av automatiserte analysen inkluderer standardisering av analysen, minimering av mellom brukeren variasjon og hands-on tid, og godtgjørelse for høy gjennomstrømming screening av vevsprøver på en pålitelig måte.
Mens immunohistochemistry (IHC) og qRT PCR tillater påvisning av skjøte varianter (spesielt EGFRvIII), i FFPE kliniske eksemplarer, disse teknikkene kan mangler nødvendig spesifisitet og tilbyr ikke innsikt i romlig oppløsning på splice variantuttrykk, henholdsvis11,12. En viktig fordel med analysen i denne protokollen er den svært sensitive og spesifikke visualiseringen av skjøte veikryss samtidig bevare morfologiske vev sammenheng. Her var analysens evne til å målrette unike ekson veikryss for flere skjøte-varianter, inkludert EGFRvIII og METΔ14, viste (tall 3 og 6). I tillegg har analysen vist å oppdage skjøte varianten AR-V7 i prostatakreft, flere isoformene av ErbB4 i hjernen, og bekreftelse av knockout av sirkulære RNA Cdr1as i musen hjernen3,13,14.
Kort målgjenkjenning sekvens av denne ISH analysen gir visualisering av RNA sekvenser idet kort idet 50 nukleotider i lengde, som demonstrert av gjenkjenning av CDR3 sekvenser fra Jurkat celler (Figur 3). Analysen kan også detektere gensekvenser som er svært homologe til andre familiemedlemmer eller arter, som vist av Revêchon et al., som brukte kort mål analysen for å oppdage menneskelige progerin uttrykt i musen subkutan hvit fettvev15. I tillegg kan liten nucleolar RNA (snoRNA), CRISPR-mediert genet redigering og forløper-microRNA være oppdaget i situ med kort mål analysen. Nylig kombinert Fu et al. denne ISH analysen med IHC å identifisere nøyaktig celler i netthinnen uttrykke pre-miRNA mir125b16.
Mutasjon profilering i svulster er avgjørende for å studere utviklingen av svulster og for utvikling av målrettet terapi. Mens mutasjon profilering kan oppnås via høy gjennomstrømming sekvensering, denne teknologien kan ikke en fullgod løsning intratumoral heterogenitet eller koble genetiske endringer med cellular morfologi17,18. Gjenkjenning av punkt mutasjoner bruker denne ISH analysen gir æren av RNA målet sekvenser på en enkelt-base-oppløsning, som godkjent av gjenkjenning av EGFR L858R og KRAS G12A single nukleotid variasjoner i linjer (figur 5). Videre brukt Baker et al. punkt mutasjon analysen målrette flere mutasjoner i BRAF KRAS og PIK3CA oncogenes i tykktarmskreft18. De kunne identifisere og romlig kart sjeldne mutant subclones av kreftceller, til slutt viser hvordan bidrar til intra-svulst heterogenitet.
Oppsummert, er en spesialisert RNA ISH analysen utviklet. Denne metoden tillater påvisning av skjøte varianter, korte sekvenser og mutasjoner i situ. Det er sensitiv, spesifikke, målbare og tilpasningsdyktig ytelse både av manuelle metoder og automatisert stainers.
The authors have nothing to disclose.
HybEZ Oven (110 or 220 VAC) or HybEZ II Oven (110 or 220V) | ACD | 310010 or 310013 (HybEZ™), 321710 or 321720 (HybEZ™ II) | |
HybEZ Humidity Control Tray (with lid) | ACD | 310012 | |
ACD EZ-Batch Slide Rack (20 slide capacity) 1 rack 310017 | ACD | 310017 | |
HybEZ Humidifying Paper | ACD | 310015 | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen (required) | Vector Laboratory | H-4000 | |
SuperFrost Plus Slides (required) | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
10% neutral-buffered formalin (NBF) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Paraffin wax | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Microtome | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Gill’s Hematoxylin I | American Master Tech Scientific/MLS | HXGHE1LT | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Xylene | Fisher Scientific/MLS | X3P-1GAL | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Tissue-Tek Vertical 24 Slide Rack | American Master Tech Scientific/MLS | LWSRA24 | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Tissue-Tek Staining Dishes | American Master Tech Scientific/MLS | LWT4457EA | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Tissue-Tek Clearing Agent Dishes, xylene resistant | American Master Tech Scientific/MLS | LWT4456EA | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
100% alcohol (EtOH) | American Master Tech Scientific/MLS | ALREACS | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
VectaMount Permanent Mounting Medium (required) | Vector Labs | H-5000 | |
Cover Glass, 24 x 50 mm | Fisher Scientific/MLS | 12-545-F | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Ammonium hydroxide, 28–30% | Sigma-Aldrich/MLS | 320145-500mL | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Carboy (>3L) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Oster Steamer Model 5712, Black and Decker Steamer HS3000, or the Braun Multiquick FS 20 Steamer | / | / | |
Digital thermometer | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Water bath or incubator, capable of holding temperature at 40 +/– 1°C | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Pipettors and tips, 1–1000 μL | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Distilled water | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Tubes (various sizes) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Fume hood | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Graduated cylinder | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Parafilm | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Paper towel or absorbent paper | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Microcentrifuge | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Microscope and accessories | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Drying oven, capable of holding temperature at 60 +/– 1°C | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Formaldehyde | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Histogel | Fisher Scientific/MLS | 22-110-678 | |
BaseScope Reagent Kit – RED | Advanced Cell Diagnostics | 322900 | |
BaseScope Hs-EGFR-E1E2 | Advanced Cell Diagnostics | 701701 | |
BaseScope Hs-EGFR-E1E8 | Advanced Cell Diagnostics | 701711 | |
BaseScope Hs-EGFR-E7E8 | Advanced Cell Diagnostics | 701721 | |
BaseScope Hs-EGFR-E8E9 | Advanced Cell Diagnostics | 701731 | |
BaseScope Hs-MET-E14E15 | Advanced Cell Diagnostics | 701811 | |
BaseScope Hs-MET-E13E15 | Advanced Cell Diagnostics | 701801 | |
BaseScope Hs-KRAS-G12A | Advanced Cell Diagnostics | 705491 | |
BaseScope Hs-KRAS-G12-nt35WT | Advanced Cell Diagnostics | 705531 | |
BaseScope Hs-EGFR-L858R | Advanced Cell Diagnostics | 705451 | |
BaseScope Hs-EGFR-L858WT | Advanced Cell Diagnostics | 705461 | |
BaseScope Control Probe Pack Human | Advanced Cell Diagnostics | 322975 |