Plate-baserte stor skala dyrking av Caenorhabditis elegans: Sample forberedelse for studiet av metabolske forandringer i Diabetes

Summary

Denne protokollen beskriver en metode for storskala dyrking av Caenorhabditis elegans på solid medier. Som et alternativ til flytende kultur kan denne protokollen få parametere av forskjellige skalaer under plate-baserte dyrking. Dette øker sammenlignbarheten resultater ved å utelate morfologiske og metabolske forskjellene mellom flytende og fast mediekultur.

Abstract

Dyrking Caenorhabditis elegans (C. elegans) i en stor måte på agar plater kan være tidkrevende og vanskelig. Denne protokollen beskriver en enkel og rimelig metode for å få et stort antall dyr for isolering av proteiner fortsette med en western blot, massespektrometri eller ytterligere Proteomikk analyser. Videre, en økning på Rundormer tall for immunostainings og integrering av flere analyser culturing oppstiller kan lett oppnås. I tillegg er en overføring mellom plater med forskjellige eksperimentelle forhold tilrettelagt. Vanlige teknikker i plate kultur innebærer overføring av en enkelt C. elegans bruke en platina ledning og overføring av befolkede agar biter ved hjelp av en skalpell. Men med økende Rundormer tall, bli disse teknikkene altfor tidkrevende. Denne protokollen beskriver store kultur C. elegans inkludert mange skritt å minimere virkningen av prøven forberedelsen på fysiologi av ormen. Væske og skjæring stress kan forandre levetid og metabolske prosesser i C. elegans, noe som krever en detaljert beskrivelse av de avgjørende skritt for å hente pålitelig og reproduserbar. C. elegans er en modell organisme, bestående av neuronal celler for opptil en tredjedel, men mangler blodkar, noe som gir muligheten til å undersøke utelukkende nevronale endringer uavhengig av vaskulær kontroll. Nylig fant tidlig neurodegeneration i diabetisk retinopati før vaskulær endringer. Dermed er C. elegans av spesiell interesse for å studere generell mekanismer for diabetiker komplikasjoner. For eksempel en økt dannelse av avanserte glycation end produkter (alder) og reaktive oksygen arter (ROS) er observert, som reproduserbar finnes i C. elegans. Protokoller for å håndtere prøver av tilstrekkelig størrelse for et bredere spekter av undersøkelser presenteres her, eksemplifisert ved studier av diabetes-indusert biokjemiske endringer. Generelt denne protokollen kan være nyttig for studier som krever store C. elegans tall og som flytende kultur er ikke egnet.

Introduction

Protein analyser, for eksempel western blot eller massespektrometri, krever milligram protein. Dette gir krever en storskala dyrking av hundrevis av C. elegans, som kan oppnås ved flytende kultur eller på solid media overføre nematoder ved vask. Væske og skjæring stress induserer uttrykk for epithelial natrium kanaler (ENaC), som kan øke osmotisk stress gjennom en økt opptak av natrium, potensielt endre levetiden C. elegans og påvirke metabolske analyser¹ . Derfor ta noen viktige skritt i denne protokollen for plate-basert tilnærming reduksjonen av stress påvirker eksperimentell variasjoner hensyn. Flytende kultur, derimot, påvirker fenotypen av nematoder og kompliserer kulturen og samling av et nøyaktig antall nematoder². Videre reaktive stoffer kan endres ved media komponentene og kan distribuere ujevnt før nematoder. Om begrensningene for flytende kultur gir denne protokollen en alternativ tilnærming til dyrking store prøver C.elegans.

C. elegans er en modell organisme med et tydelig nettverk av 302 neuronal celler, utgjør en tredjedel av alle sine celler³. Siden introduksjonen i vitenskap, mange homologe og orthologous gener er beskrevet, forsterke sin verdi som en modell for medisinsk forskning. Nylig presentert bevis for nevrologiske svekkelse i diabetisk retinopati, foregående vaskulære skader,⁴. C. elegans mangler blodkar, men inneholder et distinkt nevrale nettverk, gjør det en passende modell å undersøke nevronale endringer fra vaskulær seg. Dermed er C. elegans av spesiell interesse for å studere generell mekanismer for diabetiker komplikasjoner. Biokjemiske endringer i diabetiker komplikasjoner innebære dannelsen av aldre, som ytterligere påvirker dannelsen av ROS svar hyperglykemi⁵. Finnes i C. elegans og bidra til neuronal skade⁶. Kroniske sykdommer er ofte forårsaket av komplekse, polygenic prosesser som krever en multiparametric tilnærming for å vurdere deres underliggende mekanismer, som eksemplifisert her med vurdering av diabetiker komplikasjoner. Denne protokollen kan være til nytte for å få flere parametere samtidig, og senere. Økt sammenlignbarhet og reproduserbarhet multiparametric tilnærming kan oppnås ved å utelate morfologiske og metabolske forskjellene mellom flytende og fast mediekultur.

Protocol

Merk: Denne protokollen er inndelt i fem seksjoner. I delene 1 – 3: den viktigste protokollen til kultur C. elegans på en storstilt presenteres. Avsnitt 4 og 5 gir ytterligere protokoller for vurdering av eksemplifisert metabolitter forekommer i diabetiker metabolitter. I detalj beskriver Seksjon 1 en generell store kultur på platene. Del 2 fokuserer på overføring av store mengder C. elegans, mens del 3 forklarer høsting av et omfattende utvalg. Del 4 forklarer protein isolasjon fra utvalget og s…

Representative Results

Eksempler på å skape en storstilt C. elegans kultur her for programmer i diabetes forskningen presenteres. Det kan være av interesse å relatere parametrene til en enkelt dyr, snarere enn å normalisere den til den totale protein konsentrasjonen. En analysen som krever et lite antall nematoder, kan dette enkelt oppnås ved å telle nematoder. For en storstilt C. elegans kultur med hundrevis av nematoder per forsøksgruppen, denne tilnærmingen er upraktisk. I <strong …

Discussion

Denne protokollen presenterer en pålitelig tilnærming for storskala dyrking av C. elegans hente kvantitative resultater. Funn fra litteraturen kan replikeres som vist i Representant resultater. Selv om denne protokollen for innsamling av store prøver C. elegans virker som en rett-fram-metoden, er det visse fallgruvene ta hensyn. Om synkroniseringen av befolkningen Rundormer beskriver denne protokollen tilnærming av bleking befolkningen med natriumhypokloritt og natriumhydroksid å ?…

Materials

E. coli OP50	CGC	n/a
C. elegans N2	CGC	n/a
C. elegans CL2166	CGC	n/a
Petri dish, 60 x 15 mm	Greiner One	628161
Volumetric pipet, glas, 10 mL	Neolab	E-0413
Proteinase inhibitor cocktail tablets	Roche	04693124001
Non-denaturing lysate buffer:
Tris-HCl, pH 8	Sigma	T3253
Sodiumchloride (NaCl)	Sigma	S7653
Triton X-100	Sigma	X-100
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E5391
96-well plates, transparent bottom	Brand	781611
Infinite M200, plate reader	Tecan	30017581
Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm	Next advance	ZROB05-RNA
Bullet Blender, homogenizer	Next advance	BBX24
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma	P6887
Thymol	Sigma	T0501
Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus	Sigma	P6911
Penicillin-Streptomycin solution	Sigma	P43339
Prolidase from Porcine Kidney	Sigma	P6675
Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica	Sigma	A8200
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Merckmillipore	UFC501096
Basic Materials for plate culture are described in Reference 6.