Summary
هذا البروتوكول وصف أسلوب لزراعة ايليجانس كاينورهابديتيس على نطاق واسع في وسائل الإعلام الصلبة. كبديل لثقافة السائل، يسمح هذا البروتوكول الحصول على معلمات جداول مختلفة المزروعة المستندة إلى اللوحة. وهذا يزيد من قابلية النتائج للمقارنة بإهمال الاختلافات المورفولوجية والأيضية بين ثقافة وسائل الإعلام السائلة والصلبة.
Abstract
ويمكن استزراع ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) بصورة واسعة النطاق على لوحات أجار تستغرق وقتاً طويلاً وصعبا. ويصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وغير مكلفة للحصول على عدد كبير من الحيوانات لعزل البروتينات المضي قدما مع وصمة عار غربية أو الكتلي، أو كذلك البروتيوميات التحليلات. وعلاوة على ذلك، زيادة إعداد السلكية إيمونوستينينجس، وإدماج التحليلات متعددة نفس الظروف تثقيف يمكن بسهولة تحقيق. بالإضافة إلى ذلك، مما يسهل نقل بين لوحات مع ظروف تجريبية مختلفة. التقنيات الشائعة في لوحة الثقافة تنطوي على نقل واحد C. ايليجانس استخدام سلك البلاتين وقطع نقل أجار المأهولة بالسكان باستخدام مشرط. ومع ذلك، مع تزايد إعداد السلكية، تصبح هذه التقنيات تستغرق وقتاً طويلاً أكثر من اللازم. ويصف هذا البروتوكول ثقافة ايليجانس جيم- بما في ذلك خطوات عديدة التقليل من تأثير إعداد عينة على الفسيولوجيا الدودة على نطاق واسع. يمكن تغيير السوائل وإجهاد القص عمر وعمليات الأيض في C. ايليجانس، مما يتطلب وصفاً مفصلاً للخطوات الحاسمة من أجل استرداد نتائج موثوقة واستنساخه. C. ايليجانس كائن نموذج، تتكون من الخلايا العصبية لتصل إلى الثلث، ولكن تفتقر إلى الأوعية الدموية، مما يوفر إمكانية للتحقيق المستقلة لمراقبة الأوعية الدموية العصبية التعديلات فقط. في الآونة الأخيرة، تم العثور على نيوروديجينيريشن المبكر في اعتلال الشبكية السكري قبل التعديلات والأوعية الدموية. وهكذا، C. ايليجانس اهتماما خاصا لدراسة الآليات العامة لمضاعفات السكري. على سبيل المثال، زيادة تشكيل متقدمة glycation المنتجات النهائية (الإعمار) ويلاحظ أنواع الأكسجين التفاعلية (روس)، التي توجد في تكاثر في C. ايليجانس. بروتوكولات لمعالجة العينات ذات حجم كاف لمجموعة أوسع من التحقيقات ترد هنا، يتجلى في دراسة التعديلات البيوكيميائية التي يسببها مرض السكري. بشكل عام، هذا البروتوكول يمكن أن يكون مفيداً للدراسات التي تتطلب كبيرة C. ايليجانس أرقام وفي ثقافة السائل الذي هو غير مناسب.
Introduction
تحليل البروتين، مثل لطخة غربية أو الكتلي، تتطلب ملليغرام من البروتين. ويتطلب هذا العائد استزراع واسعة النطاق لمئات من C. ايليجانس، الذي يمكن أن يتحقق بالثقافة السائلة أو الصلبة وسائل الإعلام نقل للخيطيات قبل الغسيل. السوائل وإجهاد القص الحث على التعبير عن قنوات الصوديوم الظهارية (ايناك)، التي يمكن أن تزيد من الضغط ناضح عن طريق زيادة امتصاص الصوديوم، يحتمل أن يغير عمر C. ايليجانس والتي تؤثر على تحاليل ايضية1 . ولذلك، اتخاذ بعض الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول للنهج القائم على لوحة الحد الإجهاد التي تؤثر على تجريبية تقلب في الاعتبار. ثقافة السائل، من ناحية أخرى، يؤثر على النمط الظاهري للديدان الخيطية ويعقد في الثقافة وجمع عدد الدقيق من الديدان الخيطية2. علاوة على ذلك، يمكن تعديلها من قبل وسائل الإعلام مكونات المواد المتفاعلة ويجوز توزيع غير متساو قبل بلوغ للخيطيات. فيما يتعلق بقيود ثقافة السائل، يوفر هذا البروتوكول نهج بديل لاستزراع عينات واسعة النطاق من C. ايليجانس.
C. ايليجانس كائن نموذج مع شبكة متميزة من الخلايا العصبية 302، يشكلون ثلث جميع الخلايا لها3. منذ إطلاقها في العلم، وكثير مثلى والجينات أورثولوجوس وقد وصف، بتضخيم قيمته كنموذج للبحوث الطبية. في الآونة الأخيرة، ولم تقدم أدلة لضعف العصبية في اعتلال الشبكية السكري، السابقة لتلف الأوعية الدموية،4. C. ايليجانس تفتقر إلى الأوعية الدموية، ولكن يحتوي على شبكة الخلايا العصبية متميزة، مما يجعل من نموذج مناسب للتحقيق التعديلات العصبية وبصرف النظر عن تلك الأوعية الدموية. وهكذا، C. ايليجانس اهتماما خاصا لدراسة الآليات العامة لمضاعفات السكري. وتشمل التعديلات البيوكيميائية في مضاعفات السكري تشكيل الإعمار، وكذلك التأثير على تشكيل روس في الاستجابة لارتفاع السكر في الدم5. وتوجد في C. ايليجانس الإعمار وتسهم في تلف الخلايا العصبية6. وغالباً ما تسبب الأمراض المزمنة بالعمليات المعقدة، جينائي التي تتطلب اتباع نهج مولتيباراميتريك لتقييم تلك الآليات الكامنة، كما يتضح هنا مع تقييم لمضاعفات السكري. هذا البروتوكول يمكن استخدامها للحصول على معلمات متعددة في وقت واحد، وكذلك في وقت لاحق. يمكن زيادة القابلية للمقارنة وإمكانية تكرار نتائج نهج مولتيباراميتريك بإهمال الاختلافات المورفولوجية والأيضية بين ثقافة وسائل الإعلام السائلة والصلبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: هذا البروتوكول ينقسم إلى خمسة أقسام. ويرد في الأجزاء 1-3، البروتوكول الرئيسي للثقافة C. ايليجانس على نطاق واسع. 4 أبواب و 5 توفر البروتوكولات الإضافية لتقييم مثال ذلك نواتج الأيض التي تحدث في نواتج الأيض السكري. بالتفصيل، يصف القسم 1 ثقافة عامة واسعة النطاق على لوحات. 2 قسم يركز على نقل كميات كبيرة من C. ايليجانس، بينما يوضح القسم 3 حصاد عينة واسعة النطاق. يشرح الجزء 4 عزل البروتينات من العينة ويصف القسم 5 إعداد العينات للتحاليل اللاحقة السائل اللوني-جنبا إلى جنب الكتلي (LC-MS/MS).
1-على نطاق واسع الثقافة على لوحات
- بشكل عام، تعمل تحت غطاء معقم أو بجوار لهب المكشوف لتجنب التلوث.
-
لثقافة الديدان حتى بلوغهم مرحلة الشباب البالغين، اتبع هذا البروتوكول منشورة سابقا7 مع التعديلات التالية.
- استخدام البكتيريا الحية الإشريكيّة القولونية OP50 آر الديدان الخيطية وإعداد 400 ميكرون فلوروديوكسيوريديني أجار (لا الأمبيسلّين/فودر) للتجارب.
- لإعداد السكان متزامن، استخدام OP50 فاقة، وعن نجاح تجارب مع الكبار، استخدام 3.3 × OP50 مركزة عن طريق إزالة 70% من المادة طافية.
- ويوصي بفترات التغذية اليومية. وعند تقييم الأكسدة، فترات مختلفة وأحجام للتغذية قد تتداخل مع النتائج.
- للتلقيح، تأخذ صفيحة مع العديد من الديدان الخيطية وأجزاء من حوالي 0.5 × 1 سم2 مع مشرط. نقل قطع اثنين أو ثلاثة على لوحات إعلامية (NGM) نمو السلكية من 60 مم في القطر، والتي تحتوي على OP50 فاقة.
- احتضان لوحات عند درجة حرارة مناسبة للسلالة (N2 البرية من نوع ينبغي أن يكون مثقف في 20 درجة مئوية) حتى البيض مرئية على اللوحة.
- يغسل معظم البيض والحيوانات الكبار مع 2 مل من المخزن المؤقت M9 وجمعها في أنبوب 15 مل. الطرد المركزي بتعليق على 800 x ز 2 دقيقة. ومن ناحية أخرى، البدء في إعداد الحل تبيض.
- إخراج الأنبوب سينتريفوجيد وإزالة المخزن المؤقت M9 مع بيبيت 10 مل. أضف 10 مل من الحل ومزيج تبيض في الدوامة حتى يتم تفكيك للخيطيات الكبار. وهذا يأخذ عادة حوالي 5 – 7 دقيقة، ولكن لا ينبغي أن تستغرق وقتاً أطول من 15 دقيقة أو لا ستضع البيض تماما في وقت لاحق في التجربة.
- الطرد المركزي التعليق في 800 x ز 2 دقيقة أغسل 3 مرات مع 10 مل M9 المخزن المؤقت لمسح البيض من التبييض الحل.
- الآن إضافة 150 ميليلتر لتعليق البيض على لوحات OP50. ينبغي التوصل إلى كثافة البيض 200-300 في كل لوحة. انتظر حتى الحبليات وصلت إلى مرحلة الكبار.
ملاحظة: المخزن المؤقت M9 (pH 7.0) المستخدمة لتجارب يصور يتكون من المواد التالية: 22 مم خ2ص4، 42 مم نا2هبو4و 86 مم كلوريد الصوديوم. بعد التعقيم الخليط، إضافة 1 مم MgSO4. ويتضمن الحل تبيض 0.5 M هيدروكسيد الصوديوم، 2.3 مم NaOCl حلها في الماء المقطر. - إعداد العقيمة M9 العازلة، تلميح نصائح ماصة معقمة مع قطع يغسل بالديدان، وأنابيب 15 مل لجمعها في.
- تطبيق حوالي 1 مل من المخزن المؤقت M9 على اللوحات، بلطف توزيع المخزن المؤقت يتأرجح ولطف بيبيت للخيطيات خارج اللوحة.
- والآن، جمع الحبليات في الأنبوب. تطبيق 150 ميليلتر من التعليق مباشرة على اللوحات (المصنف مع OP50) مع نصائح قطع ماصة، وتقييم كثافة للخيطيات مجهريا (أوصى: 50 – 100 الديدان الخيطية كل لوح 60 ملم).
- إذا كانت كثيفة جداً، يؤدي إلى تمييع التعليق مع المخزن المؤقت M9 وتقييمها تحت المجهر حتى الوصول إلى الكثافة المرغوبة. إذا كان العائد القليل جداً، الديدان يستقر أو الطرد المركزي s تعليق 10 في 800 x ز لإزالة السائل.
ملاحظة: يرد مثال لكثافة كافية في الشكل 1A (العيانية) و 1B (مجهرية) في 20 X تكبير. تابع تجريبيا كما هو موضح. - نضع في اعتبارنا أن الديدان تستقر بسرعة. لضمان توزيع المتساوي بين اللوحات، عكس الأنبوب بعد كل مكدس لوحات (لوحات 4 – 5).
ملاحظة: القطع "الماصة؛" تلميح، فضلا عن يتأرجح لطيف والغسيل من اللوحات، ويقلل من إجهاد القص.
2- "نقل من كميات كبيرة" من ايليجانس كاينورهابديتيس
- يغسل للخيطيات مع حوالي 500 ميليلتر من المخزن المؤقت M9، تبعاً للعمر وجفاف اللوحات. استخدام المخزن المؤقت نفسه، كرر فصل للخيطيات حتى يتم جمع معظم الحيوانات في التعليق.
- ببطء يستغرق للخيطيات مع تلميح قطع ماصة ونقلها على لوحة أعدت مع OP50. تسمح لوحة جاف.
ملاحظة: احرص على عدم تطبيق أكثر بكثير من حجم الموصى بها. لا سيما في تجارب طويلة الأمد، اللوحات قد لا تتسامح مع ذلك ويمكن كسر أجار، السماح للديدان الخيطية الزحف في الشقوق.
3-حصاد كبير عينة ايليجانس كاينورهابديتيس
- وفقا للأسلوب المحدد، بدء تجارب مع كمية كافية من C. ايليجانس. لتحليلات LC-MS/MS، وإعداد لوحات 20 (60 ملم × 15 ملم) كل مجموعة مع حوالي 100 من الديدان الخيطية للوحة الواحدة لضمان عائد من مالا يقل عن 200 ميكروغرام من البروتين من كل عينة.
ملاحظة: هذا الجزء من البروتوكول لا تتطلب العمل تحت ظروف معقمة بعد الآن، كما سيتم جمعها الديدان الخيطية والمجمدة. - في اليوم لجمع العينات، إعداد النتروجين السائل الأداة الإضافية-تجميد العينات التي تم جمعها. الحفاظ على الجليد لإبطاء الأيض لديدان أسطوانية غير معقمة المخزن المؤقت M9.
- يغسل C. ايليجانس من اللوحات بتطبيق 1 مل من المخزن المؤقت M9 ويحوم بلطف اللوحات. هذا يؤدي إلى تجنب جمع الديدان الخيطية المتوفى ومعظم البيض، إذا كان هناك أي الحالية، نظراً لأنهم يتمسكون بالبكتيريا واجار.
- أن يصل الحجم وتحويلها إلى أنبوب 15 مل.
- وبعد جمع العينة كاملة، انتظر الحبليات تسوية أو الطرد المركزي الأنبوب بإيجاز في 800 x ز وإزالة أكثر من المخزن المؤقت M9. تغسل العينة 3 x مع ما يقرب من 10 مل M9 (10 x حجم العينة) لإزالة أي البكتيريا.
ملاحظة: لضمان أن تتم إزالة جميع الحبليات المتوفى، التعويم السكروز خيار آخر. إلا أن هذا لم يكن مناسباً ل عرض تجارب15. هو تحلل السكروز إلى جلوكوز وسكر. وقيمت دور الجلوكوز في التجارب يصور، لتشجيع التغييرات البيوكيميائية التي وجدت في مرض السكري المزمن. وهكذا، يمكن أن يحتمل أن إرباك التعويم السكروز النتائج. - إعداد أنبوب 1.5 مل واحد مع 1 مل من المخزن المؤقت M9 وأنبوب فارغ 1.5 مل واحد لكل عينة. نقل بيليه مع بيبيت زجاج من أنبوبة 15 مل إلى أنبوب فارغ 1.5 مل. تعد هذه الخطوة الحاسمة لضمان نقل كمية.
ملاحظة: على خلاف خلال الخطوات السابقة، هنا للخيطيات تتركز أكثر. بسبب انضمام إلى نصائح بيبيت البلاستيك ممكن، يتوقع خسارة جزء كبير من العينة. ولذلك، استخدام الماصات الزجاجية بدلاً من ذلك. - بعد التحويل، استخدم ماصة زجاجية لتناول 1 مل من المخزن المؤقت M9 من أنبوب 1.5 مل الثاني شطف للخيطيات من الجدار ماصة. أيضا، يغسل للخيطيات المتبقية من أنبوبة 15 مل وتحويلها إلى أنبوب عينة.
- الطرد المركزي أنبوب عينة في س 19,000 ز لمدة 1 دقيقة ثم قم بإزالة المادة طافية قدر الإمكان.
- ختم الأنبوب مع بارافيلم فورا المفاجئة-تجميد وأنها في نيتروجين سائل. تخزين الأنبوب في-80 درجة مئوية حتى إعداد ليستي.
4-البروتين عزل الكتلي
ملاحظة: عزل البروتين الموصوفة هنا يمكن أيضا استخدامها لفحوصات أخرى (مثلاً، وصمة عار الغربية).
- للعينة المجمدة، قم بإضافة نفس أحجام الخرز أكسيد الزركونيوم 0.5 مم وعلى الأقل 2 x حجم ليستي المخزن المؤقت الذي يحتوي على كوكتيل مثبط بروتيناز.
ملاحظة: أجريت التحليلات يصور الديدان الخيطية للبروتين الارتباط باستخدام 100 ميليلتر من المخزن المؤقت. تم تفكيك عينات LC-MS/MS مع 200 ميليلتر من المخزن المؤقت. - بدء الخالطون لمدة 1 دقيقة على سرعة 9. ضمان أن يتم تفكيك العينات تماما. كرر هذه الخطوة إذا لم يتم تفكيك تماما.
- الطرد المركزي في نماذج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية في س 19,000 ز. نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد على الجليد وتخزينها في-80 درجة مئوية حتى كذلك تسير القياسات التي يمكن اتخاذها.
ملاحظة: المخزن المؤقت غير يشوه المستخدمة لتجارب يصور يتكون من المواد التالية: 20 مم تريس HCl (pH 8)، 137 مم يدتا كلوريد الصوديوم و % تريتون-X 1 و 2 مم.
ملاحظة: بعد اتباع الخطوات من هذا البروتوكول، وبعد أن طبقت الجدول المقترح، ينبغي أن يكون العائد بيليه البروتين من الديدان الخيطية 1,000 تقريبا حوالي 500 ميكروغرام. لمقارنات أكثر، راجع الشكل 2 و النتائج الممثل.
5-نموذج إعداد لقياسات السائل اللوني-جنبا إلى جنب الكتلي
ملاحظة: الاعتماد على المعلمة الاهتمام، سوف تختلف إعداد عينة. ويركز هذا البروتوكول ميثيلجليوكسال وتحديد العمر.
-
قياس ميثيلجليوكسال داخل الخلايا التي derivatization مع 1، 2-ديامينوبينزيني (DB) كما هو موضح سابقا9.
- مجانسة العينات مع 20 ميليلتر من حمض التريكلوروسيتيك 20% (wt/المجلد) المثلج في كلوريد الصوديوم 0.9% (wt/المجلد) و 80 ميليلتر من الماء في أنبوب 1.5 مل.
- سبايك العينات من 5 ميليلتر مع معيار الداخلية (13ج3-ملغم؛ 400 نانومتر) ومزجها فورتيكسينج، وثم الطرد المركزي في س 21,000 ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- نقل 35 ميليلتر من المادة طافية إلى القنينة عينة [هبلك] يتضمن إدراج زجاج 200 ميليلتر.
- إضافة 5 ميليلتر من أزيد الصوديوم 3% (wt/المجلد) لكل عينة متبوعاً 10 ميليلتر من 0.5 مم DB في 200 ملم HCl المحتوية على 0.5 مم ديثيلينيتريامينبينتاسيتيك الحمضية (ديتاباك) في المياه.
- احتضان هذه العينات ح 4 في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء.
- تحليل العينات من LC-MS/MS، كما هو موضح سابقا9.
ملاحظة: لقياس الإعمار، عزل البروتينات كما هو موضح في القسم 4 من البروتوكول.
-
قياس تركيز البروتين ليساتيس (المذابة) باستخدام مقايسة برادفورد10.
- تحضير مختبرين من 30 ميليلتر لمنحنى قياسي ارتفعت مع ألبومين المصل البقري (BSA) تحل في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) تركيز التالية: 0؛ 0.1؛ 0.2؛ 0.3؛ 0.4؛ 0.6؛ 0.8؛ و 1.0 ملغ/دل.
ملاحظة: إذا كان قد أعد العينة في الحجم المقترح (راجع الخطوة 4.1 لإعداد ليستي مع 200 ميليلتر من المخزن المؤقت)، ينبغي أن يكون تركيز المقدرة في المجموعة من حوالي 2 – 7 مغ/مل. وفي هذه الحالة، تضعف العينات 01:10 مع برنامج تلفزيوني قبل القياس.
ملاحظة: للتجارب الأولى باستخدام هذا الأسلوب، ينصح بقياس العينات في تخفيف مختلف (1، 01:10، و 1: 100). حيث لا يوجد أي تحديد العدد من الديدان الخيطية الدقيقة، يمكن أن تختلف العائد بين الباحثين من الأفراد. - استخدم لوحة 96-جيدا شفافة (البوليسترين) و "الماصة؛" 10 ميليلتر من كل تركيز القياسية والعينات في تخفيف المختار في التكرارات في الآبار.
- يضعف بروتين الإنزيم صبغ كاشف التركيز 1:5 مع الماء المقطر (aq. dest.) وإضافة 200 ميليلتر من إضعاف لكل عينة على اللوحة. احتضان لوحة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- قياس امتصاص داخل 30 دقيقة في 595 نانومتر مع قارئ لوحة. يمكن محرف العينات من المنحنى المعياري المحسوب. المزيد من التفاصيل عن الطريقة التي وصفت على نطاق واسع في الأدب10.
- تحضير مختبرين من 30 ميليلتر لمنحنى قياسي ارتفعت مع ألبومين المصل البقري (BSA) تحل في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) تركيز التالية: 0؛ 0.1؛ 0.2؛ 0.3؛ 0.4؛ 0.6؛ 0.8؛ و 1.0 ملغ/دل.
-
قياس الإعمار داخل الخلايا كما هو موضح سابقا11،12.
- أغسل مقتطفات مجموع البروتين (حوالي 200 ميكروغرام) x 3 بالمياه بواسطة تنبيذ فائق في 10 وحدات الطرد المركزي تصفية كاتشين.
- إضافة 10 ميليلتر من 100 ملم HCl و 10 ميليلتر من بيبسن (2 ملغ/مل في 20 مم HCl) 10 ميليلتر من ثيمول (2 ملغ/مل في 20 مم HCl) للبروتين المستردة (حوالي 100 ميليلتر)، واحتضان هذه العينات في 37 درجة مئوية ح 24.
- تحييد والمخزن المؤقت العينات في درجة الحموضة 7.4 بإضافة ميليلتر 12.5 0.5 M بوتاسيوم فوسفات المخزن المؤقت (درجة الحموضة 7.4) و 5 ميليلتر من 260 مم كوه.
- إضافة 10 ميليلتر برنس ه [2 مغ/مل في المخزن المؤقت لفوسفات البوتاسيوم 10 مم (درجة الحموضة 7.4)] و 10 ميليلتر من حل البنسلين والستربتوميسين، واحتضان هذه العينات في 37 درجة مئوية ح 24.
- إضافة 10 ميليلتر من أمينوبيبتيداسي [2 مغ/مل في المخزن المؤقت لفوسفات البوتاسيوم 10 مم (درجة الحموضة 7.4)] و 10 ميليلتر من البروليديز [2 مغ/مل في المخزن المؤقت لفوسفات البوتاسيوم 10 مم (درجة الحموضة 7.4)]، واحتضان هذه العينات في 37 درجة مئوية ح 48.
- تحليل هيدروليساتي الناتجة من LC-MS/MS، كما هو موضح سابقا12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا أمثلة على خلق نطاق واسع C. ايليجانس الثقافة ليتم عرض التطبيقات في أبحاث مرض السكري. أنه يمكن أن يكون من مصلحة للمعلمات وتتصل حيوان واحدة، بدلاً من تطبيع فعلى تركيز البروتين الكلي. في مقايسة التي تتطلب عدد قليل من الديدان الخيطية، يمكن بسهولة يتحقق هذا عن طريق العد الديدان الخيطية. نطاق واسع C. ايليجانس للثقافة التي تشمل مئات الديدان الخيطية كل مجموعة تجريبية، وهذا النهج غير مريح. ويرد في الشكل 2، العلاقة بين مقدار C. ايليجانس ومحتوى البروتين. عزل بروتين كمية استنساخه كما هو موضح هنا، يمكن تحقيقها باستخدام هذا البروتوكول.
Amadori adduct فروكتوسيل-يسين واحد من عدة سن السلائف التي تشكلت خلال مرض السكري في الحيوانات التجريبية نماذج13. يعرض الشكل 3 قياسات LC-MS/MS بعد علاج السكر في الحبليات عمره 12 يوما ومطابقة سن ضوابط غير المعالجة من ثلاث تجارب مستقلة. وقد تجانس للخيطيات مع إضافة 200 ميليلتر ليساتي المخزن المؤقت. تشكيل فروكتوسيل-يسين بعد علاج السكر عالية ويرد زيادة.
رد الفعل من الأيض مثل ميثيلجليوكسال فلوكتوانت وتعديل البروتينات بسرعة14. ولذلك، يبقى السؤال عما إذا كانت تلك والايضات رد الفعل الواقع تتراكم في الكائن الحي أو يتم تعديلها قبل الوصول إلى الهدف. ويؤكد الشكل 4 تراكم ميثيلجليوكسال في C. ايليجانس بعد علاج مع المضمون.
يتم زيادة الأكسدة خلال6من ارتفاع السكر في الدم، وكذلك أثناء إجهاد القص. ويؤكد الشكل 5 لا فرق في تشكيل الأكسدة بين المجموعة المعالجة بالسكر، نقل كما هو الحال في المادة 2 من البروتوكول، والمجموعة غير المنقولة. تظهر مقارنة المجموعتين تعامل الجلوكوز إلى مجموعة المراقبة غير المعالجة زيادة كبيرة في الأكسدة الناجمة عن السكر. ولوحظ في المقابل، لا يوجد فرق كبير بين المجموعتين تعامل الجلوكوز. وتبين هذه النتائج أن معالجة الديدان الخيطية باستخدام هذا البروتوكول لا يحدث إلى حد كبير تشكيل الأكسدة، الذي يمكن أن يكون كونفوندير في التحقيقات المتعلقة بالشيخوخة أو التمثيل الغذائي. وعلاوة على ذلك، استنسخت النتائج التي توصل إليها في الكتابات الحالية باستخدام هذا البروتوكول.
رقم 1: كثافة كافية للديدان الخيطية أخرى لتوزيعها على ألواح. (أ) هذا الفريق ويبين وجهة نظر عيانية. (ب) هذا الفريق يبين وجهة نظر مجهرية، 20 X تكبير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: محتوى البروتين من البرية من نوع C. ايليجانس N2. هذا الترابط بين العدد من الديدان الخيطية لإنتاج البروتين، تظهر لوحة إعداد كما هو موضح في المقطع بروتوكول 5 الحبليات عمره 12 يوما في(n = 3 من الديدان الخيطية 500؛ n = 3 ليساتي من الديدان الخيطية 1,000؛ و n = 1 من الديدان الخيطية 1,500). يتم وضع علامة خط الانحدار باللون الأحمر (ص2 = 0.976، y = 0.64). وتم قياس تركيز البروتين الكلي باستخدام الأسلوب برادفورد. يتم التعبير عن البيانات يعني ± الانحراف المعياري (SD). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: زيادة تشكيل فروكتوسيل-يسين بعد علاج السكر من N2 C. ايليجانس . تركيزات فروكتوسيل-يسين بعد علاج مع الجلوكوز في الحبليات عمره 12 يوما والضوابط غير المعالجة تم تطبيع إلى تركيز بروتين يحددها الأسلوب برادفورد ويحدده LC-MS/MS. البيانات يتم التعبير عنها يعني ± التنمية المستدامة. فتم تحديد قيم من الطالب t-اختبار، * *ف < 0.01. أن النتائج من ثلاث تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: ميثيلجليوكسال داخل الخلايا تركيزات بعد علاج ميثيلجليوكسال من N2 C. ايليجانس . قيست تركيزات Methylglyoxal قبل LC-MS/MS في الحبليات عمرها 12 يوم تعامل مع ميثيلجليوكسال. وجمعت العينات أقل من 2 ح بعد العلاج الأخير. يتم التعبير عن البيانات ك SD ± يعني تطبيع للعدد من الديدان الخيطية. فتم تحديد قيم من الطالب t-اختبار، * *ف < 0.01. أن النتائج من ثلاث تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5: قياس الأكسدة CL2166 C. ايليجانس بعد علاج السكر. ترانسجينيك CL2166 (gst4::GFP) كانت مثقف8 التي تحتوي على بروتينات فلورية خضراء مروج يحركها 4 الجلوتاثيون-S-ترانسفيراز مراسل على 400 ميكرون فودر لوحات تحتوي على الجلوكوز لمد 2. مجموعة واحدة نقلت إلى لوحات جديدة الجلوكوز في يوم 1 كما هو موضح في القسم 2 من هذا البروتوكول. وتم قياس الأكسدة كزيادة في الأسفار [وحدات خفيفة نسبيا (رلو)] مع قارئ لوحة. البيانات يتم التعبير عنها يعني ± التنمية المستدامة. فتم تحديد قيم من ANOVA، *p < 0.05. أن النتائج من ثلاث تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويعرض هذا البروتوكول نهج موثوق بها لاستزراع واسعة النطاق من ايليجانس جيم للحصول على النتائج الكمية. يمكن تكرار النتائج المستمدة من الأدب كما هو موضح في نتائج الممثل. على الرغم من أن هذا البروتوكول لجمع العينات على نطاق واسع من C. ايليجانس يبدو وكأنه أسلوب مستقيم إلى الأمام، وهناك بعض العثرات تأخذ في الاعتبار. فيما يتعلق بعملية مزامنة السكان السلكية، يصف هذا البروتوكول نهج التي تبيض السكان مع هيبوكلوريت الصوديوم وهيدروكسيد الصوديوم لتدمير الديدان الخيطية وحصاد البيض فقط. فلا تؤخذ في الاعتبار أن هذا النهج قد لا يكون مناسباً لجميع التجارب. اعتماداً على نسبة حجم السكان إلى حجم الحل تبيض، يؤثر تأثير الأضرار الحل تبيض تطوير الأجنة15. خاصة عند دراسة العمليات الإنمائية، وهذا يمكن أن يكون خطوة حاسمة. وفيما يتعلق بالتعامل مع الديدان الخيطية، من الأهمية بمكان أن تطبق كقوات الإمالة قليلاً قدر الإمكان في جميع أنحاء البروتوكول. إذا لم تعالج بعناية، سوف يموت عدد كبير من الديدان الخيطية. من المهم لهذه المسألة، لا أن يتجاوز وقت الغزل والسرعة. عند نقل الديدان الخيطية، ينبغي استخدام تلميح قطع ماصة تقليل عدد الجرحى الديدان الخيطية. لنقل الديدان الخيطية، وأوصى حجم المخزن المؤقت يجب عدم تجاوزها، كما أجار قد الكراك عندما يصبح رطبة جداً، الفرصة الديدان الخيطية لحفر في اللوحة. حين جمع العينات، يجب إبقاء المخزن المؤقت M9 المثلج إلى إبطاء الأيض الديدان الخيطية، وبخاصة عند التعامل مع نواتج الأيض أو الركازات التي سوف تتحلل C. ايليجانس . من المهم أن تغسل العينة جيدا لتقليل أي التلوث البكتيري من التغذية السابقة. عند نقل بيليه، تذكر أن عدد كبير من الديدان يمكن التمسك بنصائح ماصة بلاستيكية. ينبغي أن تستخدم ماصة زجاجية الموصى بها، كما نصائح ماصة ملزمة منخفضة حتى يمكن الاحتفاظ بكمية كبيرة من العينة. وكبديل لذلك، اقترح إضافة 0.01 ٪ X100 تريتون إلى المخزن المؤقت M9 كان سابقا16. لضمان أن لا المتوفى C. ايليجانس أو البكتيريا سوف تؤثر على النتائج، يؤديها السكروز التعويم بعد يمكن أن يكون جمع للخيطيات14. عادة ما يتم هذا بعد استزراع السائل لإزالة المتوسطة. في هذه التجربة، وهذا التطهير تم حذف، لأنه يتم استقلاب السكروز إلى جلوكوز وسكر، وهكذا يحتمل الخلط نتائجنا.
عادة، يتم تنفيذ ثقافة واسعة النطاق من C. ايليجانس استخدام الوسائط السائلة. استزراع السائل، ومع ذلك، ليست مناسبة لكافة إعدادات تجريبي، خاصة عند استخدام قراءات التي تتطلب الإعداد الدقيق للديدان الخيطية. ووصف تعديل جهاز بايرمان سابقا لفرز وتنقية الحبليات المستمدة من الثقافة السائل17. هذا الأسلوب إلى حد كبير يقلل من التلوث البكتيري ومرشحات الحبليات الكبار فقط من خلال نظام تصفية مكون متعددة. ويحد هذا الأسلوب الأنيق الوقت التصفية منذ فترة طويلة (2-6 ح) في درجة حرارة الغرفة، التي يمكن الخلط بين التحليلات الأيضية. أما بالنسبة لتقنية التصفية، يتم فرز الديدان الخيطية بأنشطتها تتحرك. الديدان الخيطية يجب أن تناسب ما يكفي لتتبع الارتباطات بشكل مستقل عن طريق مسام المرشحات من مواد مختلفة. وهكذا، يمكن أن تكون مشوهة النتائج باستثناء الديدان الخيطية التي تضعف من العلاجات التجريبية.
كما يمكن أن يكون الجمع بين الثقافات السائل ولوحة في تصميم تجريبي واحد كونفوندير في تحليل لاحق. C. ايليجانس يتطور النمط الظاهري أرق وأطول في ثقافة السائل، مما يجعل من الصعب إجراء مقارنة بين البارامترات تطبيع للكتلة، كمية من البروتين، أو الجسم طول وعرض2. وعلاوة على ذلك، دراسة المواد المتفاعلة يمثل تحديا في ثقافة السائل، حيث سيتم المحتمل أن تعديل المواد المتفاعلة أو معطل بمكونات وسائل الإعلام قبل أن تصل إلى الديدان الخيطية. على الرغم من أنه يمكن الحصول على عينات واسعة النطاق من C. ايليجانس مع هذا البروتوكول، لوحة الثقافة نفسها كثيفة العمالة أكثر من ثقافة السائل. ومع ذلك، هناك طرق معينة لتسهيل المناولة (مثلاً، باستخدام جهاز الاستغناء عن أجار). وثمة خيار آخر لتعزيز ثقافة واسعة النطاق كفاءة هو استخدام أطباق بيتري مع قطر أكبر لإنتاج ألواح أجار. قد يكون هذا الخيار قيد بالتحاليل اللاحقة. لتقييم مجهرية أو لوحة معالجة عامة، إنقاص وسائل الراحة مع القطر للطبق.
نهج الفائق متعددة مناسبة لتقييم معلمات مختلفة، مثل المواد الكيميائية أو فحص المخدرات، تم وضع والتحقيق18. تسمح أجهزة موائع جزيئية الباحثين لدراسة مختلف المعايير، كما هو موضح في نموذج لداء السكري من النوع 219. عمر ودهن الأيض والأكسدة الردود يمكن في نفس الوقت تقييم على مستوى واحد والحيوان، تكشف عن مزايا فحص المحتوى السامي، الذي يدمج المظهرية مع المعلومات البيوكيميائية. تقييم مدى موثوقية وإمكانية تكرار نتائج الأدب الحالي أثبت بالفعل صقل كبيرة من هذه التقنيات، تذهب إلى أبعد من الدراسات مفهوم الإثبات18. لا تزال القدرة على تحمل التكلفة، خاصة بالنسبة لمختبرات أصغر، إشكالية، كما الأجهزة غالباً ما يكون لتخصيصها وفقا للاحتياجات التجريبية، والتي يمكن أن تكون مكلفة.
التحديد الكمي للإعمار في C. ايليجانس يعقدها بشرة كتيمة لديدان أسطوانية. هو أسلوب المستخدمة عادة الكشف عن الإعمار عبر ستينينجس إيمونوفلوريسسينت6. بسبب بشرة، يلزم أحجام عينات أكبر لتقليل الفرق عالية من النتائج. التصوير يجب أن تؤخذ في الاعتبار كعامل مضيعة للوقت.
البروتوكول المتعلق بإعداد الجسم كله ليستي الموصوفة هنا يجعل الإعمار داخل الخلايا والمكونات الأخرى من C. ايليجانس موجوداً للتحليلات. تم إجراء القياسات LC-MS/MS لعينات C. ايليجانس قبل14. ظروف تثقيف كاف، ومع ذلك، تحقيقا لعدد كاف من الديدان الخيطية، قد لا وصفت بالتفصيل، بعد.
الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول مفيد لقراءات تتطلب نطاق واسع، نمت المتجانسة السكان C. ايليجانس، أو للمزيج من قراءات متعددة للتجربة الواحدة. وهذا مناسبة خاصة لدراسة الأمراض المتعددة العوامل المعقدة مثل مرض السكري ومضاعفاته. النهج البديلة، مثل الفرز الفائق وعالية المحتوى باستخدام نظم موائع جزيئية، هي تكنولوجيا أكثر تقدما، وهي قادرة على توفير البيانات الكبيرة الحجم. تطبيقها الرئيسي يتبين حاليا في المواد الكيميائية والمخدرات الفحص أو الفحص الوراثي لطفرات الاستجابة للعلاجات التجريبية. هذا البروتوكول يساعد الباحثين على الراقي بسهولة وبتكلفة زهيدة حجم مشاريعها الحالية أو في المستقبل دون الحاجة إلى تعديل لقراءات التجريبية الحالية، وهكذا، تقليل الخسائر في أي وقت المرتبطة بإنشاء جديد أساليب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذه الدراسة كانت تدعمها الأوقيانوغرافية الألمانية (DFG) داخل 1874 إيرتج "مضاعفات microvascular السكري" و 1118 CRC "رد الفعل والايضات كسبب للسكري مضاعفات متأخرة". وقدمت سلالات C. ايليجانس N2 و CL2166 كجك، الذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة "برامج الهياكل الأساسية للبحوث" (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli OP50 | CGC | n/a | |
| C. elegans N2 | CGC | n/a | |
| C. elegans CL2166 | CGC | n/a | |
| Petri dish, 60 mm x 15 mm | Greiner One | 628161 | |
| Volumetric pipet, glas, 10 mL | Neolab | E-0413 | |
| Proteinase inhibitor cocktail tablets | Roche | 04693124001 | |
| Non-denaturing lysate buffer: | |||
| Tris-HCl, pH 8 | Sigma | T3253 | |
| Sodiumchloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5391 | |
| 96-well plates, transparent bottom | Brand | 781611 | |
| Infinite M200, plate reader | Tecan | 30017581 | |
| Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm | Next advance | ZROB05-RNA | |
| Bullet Blender, homogenizer | Next advance | BBX24 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P6887 | |
| Thymol | Sigma | T0501 | |
| Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P6911 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P43339 | |
| Prolidase from Porcine Kidney | Sigma | P6675 | |
| Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica | Sigma | A8200 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Merckmillipore | UFC501096 | |
| Basic Materials for plate culture are described in Reference 6. |
References
- Fronius, M., Clauss, W. G. Mechano-sensitivity of ENaC: may the (shear) force be with you. Pflügers Archiv. 455 (5), 775-785 (2008).
- Stiernagle, T.
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Nervous system, general description. WormAtlas. , Available from: http://www.wormatlas.org/hermaphrodite/nervous/Neuroframeset.html (2011).
- Sohn, E. H., et al. Retinal neurodegeneration may precede microvascular changes characteristic of diabetic retinopathy in diabetes mellitus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (19), E2655-E2664 (2016).
- Chilelli, N. C., Burlina, S., Lapolla, A. AGEs, rather than hyperglycemia, are responsible for microvascular complications in diabetes: a "glycoxidation-centric" point of view. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases. 23 (10), 913-919 (2013).
- Schlotterer, A., et al. C. elegans as model for the study of high glucose- mediated life span reduction. Diabetes. 58 (11), 2450-2456 (2009).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Leiers, B., et al. A stress-responsive glutathione S-transferase confers resistance to oxidative stress in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 34 (11), 1405-1415 (2003).
- Rabbani, N., Thornalley, P. J. Measurement of methylglyoxal by stable isotopic dilution analysis LC-MS/MS with corroborative prediction in physiological samples. Nature Protocols. 9 (8), 1969-1979 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 7 (72), 248-254 (1976).
- Ahmed, N., Argirov, O. K., Minhas, H. S., Cordeiro, C. A., Thornalley, P. J. Assay of advanced glycation endproducts (AGEs): surveying AGEs by chromatographic assay with derivatization by 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate and application to Nepsilon-carboxymethyl-lysine- and Nepsilon-(1-carboxyethyl)lysine-modified albumin. Biochemical Journal. 364 (Pt 1), 1-14 (2002).
- Thornalley, P. J., et al. Quantitative screening of advanced glycation endproducts in cellular and extracellular proteins by tandem mass spectrometry. Biochemical Journal. 375 (Pt 3), 581-592 (2003).
- Karachalias, N., Babaei-Jadidi, R., Ahmed, N., Thornalley, P. Accumulation of fructosyllysine and advanced glycation end products in the kidney, retina and peripheral nerve of streptozotocin-induced diabetic rats. Biochemical Society Transactions. 31, 1423-1425 (2003).
- Morcos, M., et al. Glyoxalase-1 prevents mitochondrial protein modification and enhances lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 7 (2), 260-269 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Lagido, C., McLaggan, D., Glover, L. A. A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (105), e53083 (2015).
- Takamiya, S., Mita, T. Large-scale purification of active liquid-cultured Caenorhabditis elegans using a modified Baermann apparatus. Parasitology International. 65 (5 Pt B), 580-583 (2016).
- Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. Microfluidic systems for high-throughput and high-content screening using the nematode Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 17 (22), 3736-3759 (2017).
- Zhu, G., Yin, F., Wang, L., Wei, W., Jiang, L., Qin, J. Modeling type 2 diabetes-like hyperglycemia in C. elegans on a microdevice. Integrative Biology. 8 (1), 30-38 (2016).
