מודל העכבר In Vivo הפעלת תא T CD4 תמים מידה, התפשטות של בידול Th1 הנגרם על ידי תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם
Summary
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מצפני ויוו תמים CD4 T התא (תא T) הפעלה, התפשטות, בידול Th1 המושרה על ידי מח העצם GM-CSF (מוניטור)-נגזר תאים דנדריטים (Dc). בנוסף, פרוטוקול זה מתאר בידוד מוניטור ו- T-cell דור DC, DC ו- T-cell העברה המאמצת.
Abstract
כימות של הפעלת תא CD4 T תמימה, התפשטות, בידול T helper 1 (Th1) התאים היא דרך שימושית כדי להעריך את התפקיד שממלאת בתאי T בתגובה חיסונית. פרוטוקול זה מתאר את הבידול במבחנה של מח העצם (מוניטור) אבות כדי להשיג גרנולוציט מקרופאג המושבה-מגרה פקטור (GM-CSF) נגזר-תאים דנדריטים (Dc). הפרוטוקול מתאר גם את ההעברה המאמצת של פפטיד אובלבומין (OVAp)-טעון DCs GM-CSF-derived ותאי CD4 T תמים מן העכברים הטרנסגניים OTII על מנת לנתח את הפעלת ויוו , התפשטות ו Th1 הבידול של תאי CD4 T שהועברו. פרוטוקול זה עוקף המגבלה של גרידא אין ויוו שיטות המוטלים על-ידי חוסר היכולת במיוחד לתמרן או בחר האוכלוסייה תא למד. יתר על כן, פרוטוקול זה מאפשר לימודים בסביבת ויוו , וכך להימנע שינויים לגורמים פונקציונלי שעלולות להתרחש במבחנה , לרבות את השפעת סוגי תאים וגורמים אחרים מצאו באיברים ללא פגע. הפרוטוקול הוא כלי שימושי עבור יצירת שינויים ב- DCs ו- T תאים זה לשנות את תגובות מערכת החיסון מסתגלת, פוטנציאל לספק תוצאות חשוב להבין את המקור או את התפתחות מחלות רבים הקשורים החיסון.
Introduction
תאי CD4 T אנטיגן הצגת תאים (נגמ שים) כגון DCs מגשרים נדרשת חסינות חיידקים פתוגנים1,2בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. באיברי הלימפה ההיקפית, תאי CD4 T מופעלים על הכרה של אנטיגנים ספציפיים שהוצגו על ידי נגמ שים3,4,5. תאי CD4 T מופעל להתרבות, להבדיל לתוך תאי Th ברורים אפקטור ספציפיים הדרושים להתפתחותם של תגובה חיסונית אדפטיבית נכונה6,7. שליטה על תהליכים אלה חיוני לייצור הגנה ראויה מסתגלת שהורג את הפתוגן מבלי לייצר רקמות מזיק נזק8. Th תאים מוגדרים על פי הביטוי או ייצור מולקולות על פני, גורמי שעתוק, ציטוקינים אפקטור ולבצע פונקציות חיוניות ומדויק בתגובה פתוגנים1. תאים של המשנה תא Th1 להביע את T-התערבות של גורם שעתוק של ציטוקין אינטרפרון וγ (IFNγ) ולהשתתף מארח הגנה מפני פתוגנים תאיים1. כימות של הפעלת תא CD4 T תמימה, התפשטות Th1 בידול היא אמצעי שימושי להעריך את משחק התפקידים T תאים, תגובה חיסונית.
ניתוח זה הפרוטוקול מאפשר vivo בתוך לקיבולת של חוץ גופיתבשנוצר BM-derived DCs לווסת את ההפעלה, התפשטות ו Th1 התמיינות של תאי CD4 T נאיביים. הפרוטוקול משמש גם כדי להעריך את היכולת של תאי CD4 T נאיבי להיות מופעל, המושרה כדי להתרבות, Th1 מבודלים (איור 1). פרוטוקול רב-תכליתי זה עוקף חוסר היכולת במיוחד לתמרן או בחר האוכלוסייה תא למדה גרידא אין ויוו בפרוטוקולים. ניתן יהיה ללמוד את ההשפעות של מולקולות שונות וטיפולים על בקרי תחום באמצעות מוניטור עכברים מהונדסים5 או בטיפול או מניפולציה גנטית מוניטור מבודד התאים9. באופן דומה, ניתן לסייר תא T תגובות על ידי קבלת בתאי T להעברת המאמצת ממקורות שונים או לאחר מספר מניפולציות3,8,10.
היתרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם כפולה. הפעלת תא t התפשטות, בידול Th1 ניתוח בגישה cytometry זרימה; זה בשילוב עם ויוו מחקרים, ובכך הסב שינויים שעלולות להתרחש במבחנה , לרבות סוגי תאים וגורמים אחרים מצאו איברים שלמים11.
השימוש של צבע חיוני היא טכניקה בשימוש נרחב כדי לעקוב אחר התפשטות תאים תוך הימנעות את השימוש רדיואקטיביות. מידת התפשטות עם ריאגנטים אלה מבוסס על דילול צבע לאחר חלוקת התא. יתר על כן, צבעים אלה ניתן להבחין באורכי גל מרובים, מנותחים בקלות על ידי cytometry זרימה בשילוב עם נוגדנים פלורסנט או סמני מרובים. אנחנו להדגיש את התועלת של פרוטוקול זה לפי מראה כיצד הפעלת תא T התפשטות, בידול Th1 ניתן לנתח מאת cytometry זרימה.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מאפשר אפיון הקיבולת של מוניטור-derived DCs לווסת את ההפעלה, התפשטות, התמיינות של תאי CD4 T נאיביים. יתר על כן, זה יכול לשמש גם כדי להעריך את הרגישות של תאי CD4 T מודולציה על-ידי בקרי נגזר מוניטור. עם פרוטוקול זה, שינויים באירועים אלה יכולים להיות נמדד ויוו.
בהתאם ההשערה …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ד ר סיימון ברטלט לצורך עריכה באנגלית. מחקר זה נתמך על ידי מענקים אינסטיטוטו דה סאלוד קרלוס השלישי (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), ושל מיגל Servet התוכנית Fundación רמון Areces; עם השתתפות במימון של הועדה המחוזית Fondo Europeo דה Desarrollo (פדר). CNIC נתמך על ידי משרד הכלכלה, התעשייה, תחרותיות (MEIC), קרן CNIC Pro, Severo אוצ’ואה התמחות (SEV-2015-0505). RTF היא נוסדה על ידי Fundación רמון Areces, CNIC, VZG על ידי ISCIII, BHF על ידי דה אינסטיטוטו Investigación Sanitaria חולים 12 דה אוקטוברה (imas12) ו- jmg ב- G על ידי תוכנית Servet של מיגל ISCIII imas12.
Materials
| Ethanol | VWR Chemicals | 20,824,365 | 5 L |
| Scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14001-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11000-13 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11253-20 | |
| Scalpel | Fine Science Tools (F.S.T.) | 10020-00 | Box of 100 blades |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA | F7524 | |
| Penicillin/streptomycin | LONZA | DE17-602E | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | GIBCO | 21875-034 | |
| Sterile Petri dishes | Falcon | 353003 | |
| 25-gauge needle | BD Microlance 3 | 300600 | |
| 1 ml syringe | Novico | N15663 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 70 μm nylon web filter | BD Falcon | 352350 | |
| Red blood lysis buffer | SIGMA | R7757 | 100 Ml |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | 100 g |
| Trypan blue | SIGMA | 302643-25G | |
| Culture-plates | Falcon | 353003 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Cambrex | BE17-737E | |
| Beta-mercaptoethanol | Merck | 8-05740-0250 | |
| Sodium pyruvate | LONZA | BE13-115E | |
| L-glutamine | LONZA | BE17-605E | |
| Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) | Prepotech | 315-03 | |
| lipopolysaccharide (LPS) | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| 96-well-plate | Costar | 3799 | |
| v450 anti-mouse CD11b antibody | BD Biosciences | 560455 | |
| PE anti-mouse CD64 antibody | BioLegend | 139303 | |
| PE anti-mouse CD115 antibody | BioLegend | 135505 | |
| FITC anti-mouse CD11c antibody | BioLegend | 117305 | |
| FITC anti-mouse MHCII antibody | BioLegend | 125507 | |
| APC anti-mouse CD86 antibody | BioLegend | 105011 | |
| APC anti-mouse CD80 antibody | BioLegend | 104713 | |
| Flow Cytometry tubes | Zelian | 300800-1 | PS 12X75 5mL |
| OTII Ovoalbumine peptide | InvivoGen | 323-339 | |
| anti-mouse biotinylated CD8α antibody | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| anti-mouse biotinylated IgM antibody | BioLegend | 406503 | |
| anti-mouse biotinylated B220 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD19 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody | BioLegend | 115302 | |
| anti-mouse biotinylated CD11b antibody | Tonbo Biosciences | 30-0112-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD11c antibody | BioLegend | 117303 | |
| anti-mouse biotinylated CD44 antibody | BioLegend | 103003 | |
| anti-mouse biotinylated CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| anti-mouse biotinylated DX5 antibody | BioLegend | 108903 | |
| streptavidin-coated magnetic microbeads | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| Magnetic cell separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | QuadroMACS Separator |
| Separation columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| PE anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100408 | |
| APC anti-mouse CD3 antibody | BioLegend | 100235 | |
| FITC anti-mouse CD8 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Cell Violet Tracer | Thermofisher | C34557 | |
| APC anti-mouse CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 anti-mouse CD69 antibody | BioLegend | 104518 | |
| PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0453 | |
| PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC anti-mouse CD45.2 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| Ionomycin | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldin A (BD GolgiPlug) | BD | 555029 | |
| Paraformaldehyde | Millipore | 8-18715-02100 | |
| Intracellular permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333 | |
| APC anti-mouse IFNg antibody | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6.SJL CD45.1 mice | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BD LSRFortessa™ Cell Analyzer | BD Biosciences | 649225 | |
| DAPI Solution | Thermofisher | 62248 |
References
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
- Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lymphocyte Polarity in Cognate Immune Cell-Cell Interactions. International Review of Cell and Molecular Biology. 327, 195-261 (2016).
- Gonzalez-Granado, J. M., et al. Nuclear envelope lamin-A couples actin dynamics with immunological synapse architecture and T cell activation. Science Signaling. 7 (322), ra37 (2014).
- Rocha-Perugini, V., Gonzalez-Granado, J. M. Nuclear envelope lamin-A as a coordinator of T cell activation. Nucleus. 5 (5), 396-401 (2014).
- Rocha-Perugini, V., et al. CD9 Regulates Major Histocompatibility Complex Class II Trafficking in Monocyte-Derived Dendritic Cells. Molecular and Cellular Biology. 37 (15), (2017).
- Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nature Reviews Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).
- Iborra, S., Gonzalez-Granado, J. M. In Vitro Differentiation of Naive CD4(+) T Cells: A Tool for Understanding the Development of Atherosclerosis. Methods in Molecular Biology. 1339, 177-189 (2015).
- Toribio-Fernandez, R., et al. Lamin A/C augments Th1 differentiation and response against vaccinia virus and Leishmania major. Cell Death & Disease. 9 (1), 9 (2018).
- Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
- Cruz-Adalia, A., et al. Conventional CD4(+) T cells present bacterial antigens to induce cytotoxic and memory CD8(+) T cell responses. Nature Communications. 8 (1), 1591 (2017).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of Visualized Experiments. (88), e51627 (2014).
- Cruz-Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacon, E. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. Journal of Visualized Experiments. (107), e52976 (2016).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584-1797 (2017).
- Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. Journal of Immunological Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animals (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral transduction of naive CD4 T cells to study Treg differentiation. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
