Vivo fare modeli ölçü saf CD4 T Hücre aktivasyonu, yayılması ve kemik iliği türevi dendritik hücreler tarafından indüklenen Th1 farklılaşma
Summary
Burada, bir protokol saf CD4 T hücre (T hücre) etkinleştirme, yayılması ve GM-CSF kemik iliği (BM) tarafından indüklenen Th1 farklılaşma vivo içinde belirlenmesi için mevcut-dendritik hücreler (DC) türetilmiş. Ayrıca, bu iletişim kuralını BM ve T-hücre izolasyon, DC üretimi ve DC ve T hücreli evlat edinen transfer açıklar.
Abstract
Miktar (Th1) saf CD4 T Hücre aktivasyonu, yayılması ve farklılaşma T yardımcı 1 için hücreleri T hücreleri bir bağışıklık yanıtındaki oynadığı rol değerlendirmek için yararlı bir yoldur. Bu iletişim kuralı granülosit makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) türetilmiş-dendritik hücreler (DC) elde etmek için kemik iliği (BM) ataları vitro farklılaşma açıklar. Protokol ayrıca ovalbumin peptid (OVAp) evlat edinen transferini açıklanır-GM-CSF-türetilmiş DCs ve saf CD4 T hücreleri OTII transgenik fareler vivo içinde harekete geçirmek, yayılması ve Th1 farklılaşma çözümlemek amacıyla yüklü Transfer edilen CD4 T hücreleri. Bu iletişim kuralı tamamen in vivo Yöntemler özellikle işlemek veya okudu hücre nüfus seçmek için yetersizlik tarafından dayatılan sınırlandırılması kaçınmanızı sağlar. Ayrıca, bu protokol çalışmaları böylece değişiklikler vitro oluşabilir fonksiyonel etkenler ve hücre tipleri ve sadece olduğu gibi organlarda bulunan diğer faktörlerin etkisi kaçınarak bir in vivo ortamda olanak sağlar. Protokol değişiklikleri DCs içinde oluşturmak için yararlı bir araçtır ve T hücreleri edinilmiş bağışıklık yanıtı, potansiyel olarak kökenli veya çok sayıda bağışıklık ilişkili hastalıkları gelişimi anlamak için önemli sonuçları sağlamanın değiştirin.
Introduction
CD4 T hücreleri ve antijen sunan hücreler (ZPT) DCs gibi bağışıklık mikrobiyal patojenler1,2için gerekli ortam araçları vardır. Periferik lenfoid organlarda CD4 T hücreleri belirli antijenleri ZPT3,4,5tarafından sunulan tanınması üzerine aktif hale gelir. Aktif CD4 T hücreleri çoğalırlar ve doğru edinilmiş bağışıklık yanıtı6,7gelişimi için gerekli olan farklı belirli efektör Th hücrelerine ayırt etmek. Bu işlemlerin kontrolünü zararlı doku hasarı8üretmeden patojen öldürür yeterli bir adaptif savunma üretmek için önemlidir. İnci hücreleri ifade veya yüzey molekülleri, transkripsiyon faktörleri ve efektör sitokinlerin üretimini göre tanımlanır ve önemli ve hassas fonksiyonları yanıt patojenlerin1. Hücre Th1 hücre alt transkripsiyon faktörü T-bahis ve sitokin interferon γ (IFNγ) hızlı ve intrasellüler patojenlerin1karşı ana savunma katılmak. Miktar saf CD4 T Hücre aktivasyonu, yayılması ve Th1 farklılaşma rol T hücreleri oyunda bir bağışıklık yanıtı değerlendirirken yararlı bir araçtır.
Bu iletişim kuralı sağlar içinde vivo çözümleme kapasiteleri için in vitro –BM kaynaklı DCs harekete geçirmek, yayılması ve saf CD4 T hücrelerinin Th1 farklılaşma modüle oluşturulan. İletişim kuralı da saf CD4 T hücreleri aktive, çoğalırlar indüklenen için kapasitesini değerlendirmek için hizmet vermektedir ve Th1 (Şekil 1) farklı. Bu çok yönlü iletişim kuralı yetersizlik özellikle işlemek veya tamamen vivo içinde iletişim kuralları’nda okudu hücre nüfus seçin kaçınmanızı sağlar. Çeşitli moleküller ve DCs tedavisi etkileri genetiği değiştirilmiş fare5 BM kullanarak veya tedavi ya da genetik olarak izole BM hücreleri9manipüle okudu olabilir. Benzer şekilde, T hücre yanıt-e doğru farklı kaynaklardan veya çeşitli manipülasyonlar3,8,10sonra T hücreleri evlat edinen transfer için alma tarafından keşfedilmeyi olabilir.
İki kat bu protokolü başlıca avantajları şunlardır. T Hücre aktivasyonu, yayılmasını önleme ve Th1 farklılaşma bir akış sitometresi yaklaşımla analiz edilir; ve bu böylece vitro oluşabilecek değişiklikler önlenmesi ve hücre tipleri ve sadece sağlam organları11‘ de bulunan diğer faktörler de dahil olmak üzere in vivo çalışmalar ile birlikte yürür.
Hayati boya kullanımı radyoaktivite kullanımı kaçınırken hücre çoğalması izlemek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Nükleer silahların yayılmasına karşı bu kimyasalları ile ölçüm boya seyreltme hücre bölünmesi sonra temel alır. Ayrıca, bu boyalar birden çok dalga boylarında tespit edilebilir ve kolayca birden çok floresan antikor veya işaretleri ile akış sitometresi tarafından incelenir. Biz bu protokolü yardımcı programını nasıl T Hücre aktivasyonu, yayılmasını önleme ve Th1 farklılaşma akış sitometresi tarafından çözümlenebilir göstererek vurgulayın.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı etkinleştirme, yayılması ve saf CD4 T hücrelerinin farklılaşma modüle için BM kaynaklı DCs kapasitesini karakterizasyonu için izin verir. Ayrıca, aynı zamanda CD4 T hücrelerinin modülasyonu karşı hassasiyeti değerlendirmek için BM kaynaklı DC’ler tarafından kullanılabilmesi için. Bu iletişim kuralı ile ölçülen vivo içindebu olaylar değişimler olabilir.
Soruşturma altında hipotez bağlı olarak, T hücreleri ve DCs çeşitli bileşim…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Simon Bartlett İngilizce düzenleme için teşekkür ediyoruz. Bu çalışmada: Instituto de hibe tarafından desteklenmiştir Salud Carlos III (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), Miguel Servet Program ve Fundación Ramón Areces; Fondo Europeo de Desarrollo bölgesel (FEDER) ortak fon ile. CNIC Ekonomi Bakanlığı, sanayi ve rekabet (MEIC) ve Pro CNIC Foundation tarafından desteklenen ve bir Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505) olduğunu. RTF Fundación Ramón Areces ve CNIC, VZG ISCIII, Instituto de birimi BHF tarafından kurulan Investigación Sanitaria hastane 12 de Octubre (imas12) ve JMG-G ISCIII Miguel Servet Program ve imas12.
Materials
| Ethanol | VWR Chemicals | 20,824,365 | 5 L |
| Scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14001-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11000-13 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11253-20 | |
| Scalpel | Fine Science Tools (F.S.T.) | 10020-00 | Box of 100 blades |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA | F7524 | |
| Penicillin/streptomycin | LONZA | DE17-602E | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | GIBCO | 21875-034 | |
| Sterile Petri dishes | Falcon | 353003 | |
| 25-gauge needle | BD Microlance 3 | 300600 | |
| 1 ml syringe | Novico | N15663 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 70 μm nylon web filter | BD Falcon | 352350 | |
| Red blood lysis buffer | SIGMA | R7757 | 100 Ml |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | 100 g |
| Trypan blue | SIGMA | 302643-25G | |
| Culture-plates | Falcon | 353003 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Cambrex | BE17-737E | |
| Beta-mercaptoethanol | Merck | 8-05740-0250 | |
| Sodium pyruvate | LONZA | BE13-115E | |
| L-glutamine | LONZA | BE17-605E | |
| Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) | Prepotech | 315-03 | |
| lipopolysaccharide (LPS) | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| 96-well-plate | Costar | 3799 | |
| v450 anti-mouse CD11b antibody | BD Biosciences | 560455 | |
| PE anti-mouse CD64 antibody | BioLegend | 139303 | |
| PE anti-mouse CD115 antibody | BioLegend | 135505 | |
| FITC anti-mouse CD11c antibody | BioLegend | 117305 | |
| FITC anti-mouse MHCII antibody | BioLegend | 125507 | |
| APC anti-mouse CD86 antibody | BioLegend | 105011 | |
| APC anti-mouse CD80 antibody | BioLegend | 104713 | |
| Flow Cytometry tubes | Zelian | 300800-1 | PS 12X75 5mL |
| OTII Ovoalbumine peptide | InvivoGen | 323-339 | |
| anti-mouse biotinylated CD8α antibody | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| anti-mouse biotinylated IgM antibody | BioLegend | 406503 | |
| anti-mouse biotinylated B220 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD19 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody | BioLegend | 115302 | |
| anti-mouse biotinylated CD11b antibody | Tonbo Biosciences | 30-0112-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD11c antibody | BioLegend | 117303 | |
| anti-mouse biotinylated CD44 antibody | BioLegend | 103003 | |
| anti-mouse biotinylated CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| anti-mouse biotinylated DX5 antibody | BioLegend | 108903 | |
| streptavidin-coated magnetic microbeads | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| Magnetic cell separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | QuadroMACS Separator |
| Separation columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| PE anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100408 | |
| APC anti-mouse CD3 antibody | BioLegend | 100235 | |
| FITC anti-mouse CD8 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Cell Violet Tracer | Thermofisher | C34557 | |
| APC anti-mouse CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 anti-mouse CD69 antibody | BioLegend | 104518 | |
| PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0453 | |
| PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC anti-mouse CD45.2 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| Ionomycin | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldin A (BD GolgiPlug) | BD | 555029 | |
| Paraformaldehyde | Millipore | 8-18715-02100 | |
| Intracellular permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333 | |
| APC anti-mouse IFNg antibody | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6.SJL CD45.1 mice | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BD LSRFortessa™ Cell Analyzer | BD Biosciences | 649225 | |
| DAPI Solution | Thermofisher | 62248 |
References
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
- Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lymphocyte Polarity in Cognate Immune Cell-Cell Interactions. International Review of Cell and Molecular Biology. 327, 195-261 (2016).
- Gonzalez-Granado, J. M., et al. Nuclear envelope lamin-A couples actin dynamics with immunological synapse architecture and T cell activation. Science Signaling. 7 (322), ra37 (2014).
- Rocha-Perugini, V., Gonzalez-Granado, J. M. Nuclear envelope lamin-A as a coordinator of T cell activation. Nucleus. 5 (5), 396-401 (2014).
- Rocha-Perugini, V., et al. CD9 Regulates Major Histocompatibility Complex Class II Trafficking in Monocyte-Derived Dendritic Cells. Molecular and Cellular Biology. 37 (15), (2017).
- Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nature Reviews Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).
- Iborra, S., Gonzalez-Granado, J. M. In Vitro Differentiation of Naive CD4(+) T Cells: A Tool for Understanding the Development of Atherosclerosis. Methods in Molecular Biology. 1339, 177-189 (2015).
- Toribio-Fernandez, R., et al. Lamin A/C augments Th1 differentiation and response against vaccinia virus and Leishmania major. Cell Death & Disease. 9 (1), 9 (2018).
- Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
- Cruz-Adalia, A., et al. Conventional CD4(+) T cells present bacterial antigens to induce cytotoxic and memory CD8(+) T cell responses. Nature Communications. 8 (1), 1591 (2017).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of Visualized Experiments. (88), e51627 (2014).
- Cruz-Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacon, E. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. Journal of Visualized Experiments. (107), e52976 (2016).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584-1797 (2017).
- Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. Journal of Immunological Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animals (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral transduction of naive CD4 T cells to study Treg differentiation. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
