एक Vivo माउस मॉडल में भोली CD4 टी सेल सक्रियण, प्रसार और Th1 अस्थि मज्जा द्वारा प्रेरित भेदभाव-व्युत्पंन वृक्ष कोशिकाओं को मापने के लिए
Summary
यहां, हम में vivo संकल्प के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद भोली CD4 टी सेल (टी सेल) सक्रियकरण, प्रसार, और Th1 जीएम द्वारा प्रेरित-सीएसएफ अस्थि मज्जा (बी एम)-व्युत्पंन वृक्ष कोशिकाओं (dc) । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल का वर्णन बीएम और टी सेल अलगाव, डीसी पीढ़ी, और डीसी और टी सेल adoption हस्तांतरण ।
Abstract
ठहराव की भोली CD4 टी सेल सक्रियण, प्रसार, और टी सहायक 1 (Th1) कोशिकाओं को भेदभाव एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में टी कोशिकाओं द्वारा निभाई गई भूमिका का आकलन करने के लिए एक उपयोगी तरीका है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन इन विट्रो अस्थि मज्जा (बीएम) progenitors के granulocyte मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक फैक्टर (जीएम-सीएसएफ) व्युत्पंन-वृक्ष कोशिकाओं (dc) प्राप्त करने के लिए में भेदभाव । प्रोटोकॉल भी ovalbumin पेप्टाइड के दत्तक हस्तांतरण का वर्णन (OVAp)-लोड जीएम-सीएसएफ-व्युत्पंन dc और भोली CD4 टी कोशिकाओं OTII ट्रांसजेनिक चूहों से आदेश में vivo सक्रियण, प्रसार, और Th1 विभेद का विश्लेषण करने के लिए CD4 टी कोशिकाओं का तबादला. इस प्रोटोकॉल में विशुद्ध रूप से vivo की सीमा को विशेष रूप से हेरफेर या अध्ययन सेल जनसंख्या का चयन करने के लिए अक्षमता द्वारा लगाए गए तरीकों को दरकिनार । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में एक vivo वातावरण में अध्ययन की अनुमति देता है, इस प्रकार कार्यात्मक कारकों में परिवर्तन से परहेज है कि इन विट्रो में हो सकता है और सेल प्रकार और अंय कारकों के प्रभाव के साथ ही बरकरार अंगों में पाया । प्रोटोकॉल dc और टी कोशिकाओं है कि अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को संशोधित करने में परिवर्तन पैदा करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है, संभवतः महत्वपूर्ण परिणाम प्रदान करने के लिए मूल या कई प्रतिरक्षा जुड़े रोगों के विकास को समझते हैं ।
Introduction
CD4 टी कोशिकाओं और प्रतिजन पेश कोशिकाओं (APCs) ऐसे dc के रूप में सूक्ष्म जीवाणु रोगजनकों के लिए प्रतिरक्षा के मध्यस्थों की आवश्यकता है1,2. परिधीय लसीकावत् अंगों में, CD4 टी कोशिकाओं APCs3,4,5द्वारा प्रस्तुत विशिष्ट एंटीजन की पहचान पर सक्रिय कर रहे हैं । सक्रिय CD4 टी कोशिकाओं पैदा करना और अलग विशिष्ट प्रभाव वें कोशिकाओं है कि एक सही अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया6,7के विकास के लिए आवश्यक है में अंतर । इन प्रक्रियाओं के नियंत्रण हानिकारक ऊतक नुकसान8उत्पादन के बिना रोगज़नक़ को मारता है कि एक पर्याप्त अनुकूली रक्षा के उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण है । गु कोशिकाओं अभिव्यक्ति या सतह अणुओं, प्रतिलेखन कारकों, और प्रभाव साइटोकिंस के उत्पादन के अनुसार परिभाषित कर रहे है और रोगजनकों के जवाब में आवश्यक और सटीक कार्य प्रदर्शन1। Th1 सेल सबसेट की कोशिकाओं प्रतिलेखन कारक टी शर्त और cytokine इंटरफेरॉन γ (IFNγ) एक्सप्रेस और intracellular रोगजनकों के खिलाफ मेजबान रक्षा में भाग1। ठहराव की भोली CD4 टी कोशिका सक्रियण, प्रसार, और Th1 भेदभाव एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में भूमिका टी कोशिकाओं का आकलन करने का एक उपयोगी साधन है ।
इस प्रोटोकॉल में vivo की क्षमता का विश्लेषण में सक्षम बनाता है इन विट्रो-उत्पंन बीएम-व्युत्पंन dc के लिए सक्रियण, प्रसार, और भोली CD4 टी कोशिकाओं के Th1 भेदभाव मिलाना । प्रोटोकॉल भी भोली CD4 टी कोशिकाओं की क्षमता का आकलन करने के लिए सक्रिय हो, पैदा करना को प्रेरित कार्य करता है, और Th1 विभेदित (1 चित्रा) । इस बहुमुखी प्रोटोकॉल को विशेष रूप से हेरफेर या विशुद्ध रूप से vivo प्रोटोकॉल में अध्ययन सेल जनसंख्या का चयन करने में असमर्थता दरकिनार । विभिंन अणुओं और dc पर उपचार के प्रभाव से बीएम का उपयोग करके अध्ययन किया जा सकता है आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों5 या इलाज या आनुवंशिक रूप से अलग बीएम कोशिकाओं9से जोड़ तोड़ । इसी प्रकार, टी सेल प्रतिक्रियाओं अलग स्रोतों से या कई जोड़तोड़3,8,10के बाद अपनाने स्थानांतरण के लिए टी कोशिकाओं को प्राप्त करने के द्वारा पता लगाया जा सकता है ।
इस प्रोटोकॉल का मुख्य लाभ दोहरा हैं । टी सेल सक्रियण, प्रसार, और Th1 भेदभाव एक प्रवाह cytometry दृष्टिकोण के साथ विश्लेषण कर रहे हैं; और इस के साथ vivo अध्ययन में संयुक्त है, इस प्रकार परिवर्तन है कि इन विट्रो में हो सकता है और सेल प्रकार और अंय कारक केवल बरकरार अंगों11में पाया सहित टल ।
महत्वपूर्ण रंजक का उपयोग रेडियोधर्मिता के उपयोग से परहेज करते हुए सेल प्रसार को ट्रैक करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल तकनीक है । इन रिएजेंट के साथ प्रसार की माप कोशिका विभाजन के बाद डाई कमजोर पड़ने पर आधारित है । इसके अलावा, इन रंगों कई तरंग दैर्ध्य में पता लगाया जा सकता है और आसानी से कई फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी या मार्कर के साथ संयोजन में प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं । हम कैसे टी सेल सक्रियण, प्रसार दिखाकर इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता पर प्रकाश डाला, और Th1 भेदभाव प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल की क्षमता के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है बीएम-व्युत्पंन dc प्राप्त करने के लिए सक्रियण, प्रसार, और भोले CD4 टी कोशिकाओं के भेदभाव । इसके अलावा, यह भी बीएम-व्युत्पन्न dc द्वारा मॉडुलन करने क…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अंग्रेजी संपादन के लिए डॉ साइमन बार्टलेट धंयवाद । इस अध्ययन Instituto de Salud कार्लोस III (ISCIII) (PI14/00526 से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), Miguel Servet कार्यक्रम और Fundación रामोन Areces; Fondo Europeo de Desarrollo क्षेत्रीय (FEDER) से सह-धन के साथ । CNIC अर्थव्यवस्था, उद्योग और प्रतिस्पर्धात्मकता (MEIC), और प्रो CNIC फाउंडेशन के मंत्रालय द्वारा समर्थित है और उत्कृष्टता के एक Severo Ochoa केंद्र (SEV-2015-0505) है । RTF द्वारा स्थापित किया गया है Fundación रामोन Areces और CNIC, VZG द्वारा ISCIII, BHF द्वारा Instituto de Investigación Sanitaria अस्पताल 12 de अक्टूबर, (imas12) और JMG-G द्वारा ISCIII Miguel Servet कार्यक्रम और imas12.
Materials
| Ethanol | VWR Chemicals | 20,824,365 | 5 L |
| Scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14001-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11000-13 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11253-20 | |
| Scalpel | Fine Science Tools (F.S.T.) | 10020-00 | Box of 100 blades |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA | F7524 | |
| Penicillin/streptomycin | LONZA | DE17-602E | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | GIBCO | 21875-034 | |
| Sterile Petri dishes | Falcon | 353003 | |
| 25-gauge needle | BD Microlance 3 | 300600 | |
| 1 ml syringe | Novico | N15663 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 70 μm nylon web filter | BD Falcon | 352350 | |
| Red blood lysis buffer | SIGMA | R7757 | 100 Ml |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | 100 g |
| Trypan blue | SIGMA | 302643-25G | |
| Culture-plates | Falcon | 353003 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Cambrex | BE17-737E | |
| Beta-mercaptoethanol | Merck | 8-05740-0250 | |
| Sodium pyruvate | LONZA | BE13-115E | |
| L-glutamine | LONZA | BE17-605E | |
| Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) | Prepotech | 315-03 | |
| lipopolysaccharide (LPS) | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| 96-well-plate | Costar | 3799 | |
| v450 anti-mouse CD11b antibody | BD Biosciences | 560455 | |
| PE anti-mouse CD64 antibody | BioLegend | 139303 | |
| PE anti-mouse CD115 antibody | BioLegend | 135505 | |
| FITC anti-mouse CD11c antibody | BioLegend | 117305 | |
| FITC anti-mouse MHCII antibody | BioLegend | 125507 | |
| APC anti-mouse CD86 antibody | BioLegend | 105011 | |
| APC anti-mouse CD80 antibody | BioLegend | 104713 | |
| Flow Cytometry tubes | Zelian | 300800-1 | PS 12X75 5mL |
| OTII Ovoalbumine peptide | InvivoGen | 323-339 | |
| anti-mouse biotinylated CD8α antibody | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| anti-mouse biotinylated IgM antibody | BioLegend | 406503 | |
| anti-mouse biotinylated B220 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD19 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody | BioLegend | 115302 | |
| anti-mouse biotinylated CD11b antibody | Tonbo Biosciences | 30-0112-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD11c antibody | BioLegend | 117303 | |
| anti-mouse biotinylated CD44 antibody | BioLegend | 103003 | |
| anti-mouse biotinylated CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| anti-mouse biotinylated DX5 antibody | BioLegend | 108903 | |
| streptavidin-coated magnetic microbeads | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| Magnetic cell separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | QuadroMACS Separator |
| Separation columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| PE anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100408 | |
| APC anti-mouse CD3 antibody | BioLegend | 100235 | |
| FITC anti-mouse CD8 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Cell Violet Tracer | Thermofisher | C34557 | |
| APC anti-mouse CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 anti-mouse CD69 antibody | BioLegend | 104518 | |
| PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0453 | |
| PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC anti-mouse CD45.2 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| Ionomycin | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldin A (BD GolgiPlug) | BD | 555029 | |
| Paraformaldehyde | Millipore | 8-18715-02100 | |
| Intracellular permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333 | |
| APC anti-mouse IFNg antibody | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6.SJL CD45.1 mice | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BD LSRFortessa™ Cell Analyzer | BD Biosciences | 649225 | |
| DAPI Solution | Thermofisher | 62248 |
References
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