Eine In Vivo Mausmodell Maßnahme naive CD4-T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Th1 Differenzierung induziert durch Knochenmark-abgeleitete Dendritische Zellen
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur in Vivo Bestimmung der naiven CD4-T Zellaktivierung (T Cell), Proliferation und Th1 Differenzierung induziert durch GM-CSF Knochenmark (BM)-abgeleitete Dendritische Zellen (DCs). Darüber hinaus beschreibt dieses Protokolls BM und T-Zellen isoliert, DC-Generation und DC und T-Zell-Adoptiv-Transfer.
Abstract
Quantifizierung der naiven CD4-T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Differenzierung zu T-Helfer 1 (Th1) Zellen ist eine nützliche Methode, um die Rolle der T-Zellen in einer Immunantwort zu beurteilen. Dieses Protokoll beschreibt die in Vitro Differenzierung von Knochenmark (BM) Stammväter Granulozyten Makrophagen Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) abgeleitet-Dendritische Zellen (DCs) zu erhalten. Das Protokoll beschreibt auch die Adoptiveltern Übertragung von Ovalbumin Peptid (OVAp)-GM-CSF-derived DCs und naive CD4-T-Zellen aus transgenen Mäusen OTII geladen, um die in-Vivo -Aktivierung, Verbreitung und Th1 Differenzierung zu analysieren die übertragenen CD4-T-Zellen. Dieses Protokoll umgeht die Begrenzung der rein in Vivo Methoden durch die Unfähigkeit, speziell zu manipulieren oder wählen die untersuchten Zellpopulation. Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokolls Studien in einer in-Vivo -Umgebung, wodurch Veränderungen funktionale Faktoren, die in Vitro auftreten können sowie den Einfluss von Zelltypen und andere Faktoren, die nur in intakten Organe gefunden. Das Protokoll ist ein nützliches Werkzeug zur Erzeugung von Änderungen in DCs und T-Zellen, die adaptive Immunantworten, Bereitstellung von potenziell wichtige Ergebnisse zu verstehen, den Ursprung oder die Entwicklung von zahlreichen damit verbundenen Immunerkrankungen zu ändern.
Introduction
CD4-T-Zellen und antigenpräsentierende Zellen (APCs) wie DCs sind erforderliche Mediatoren der Immunität gegen mikrobiellen Krankheitserregern1,2. In den peripheren lymphatischen Organen werden CD4-T-Zellen bei der Anerkennung der spezifischen Antigene präsentiert von APCs3,4,5aktiviert. Aktivierte CD4-T-Zellen vermehren sich und differenzieren in verschiedene spezifische Th Effektorzellen, die notwendig sind für die Entwicklung eines korrekten adaptiven Immunantwort6,7. Kontrolle dieser Prozesse ist entscheidend für die Herstellung einer angemessenen adaptive Verteidigung, die den Erreger abtötet ohne schädliche Gewebe Schaden8zu produzieren. Th-Zellen werden nach den Ausdruck oder die Produktion von Oberflächenmoleküle, Transkriptionsfaktoren und Effektor Zytokine definiert und wesentliche und präzise Funktionen in Reaktion auf Krankheitserreger1. Zellen der Th1-Zelle Teilmenge Transkriptionsfaktors T-Bet und das Zytokin Interferon-γ (IFNγ) Ausdrücken und in der Wirt Verteidigung gegen intrazelluläre Erreger1teilnehmen. Quantifizierung der naiven CD4-T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Differenzierung der Th1 ist ein nützliches Mittel zur Beurteilung der T Zellen Rolle bei einer Immunantwort.
Dieses Protokoll ermöglicht in Vivo Analyse der Leistungsfähigkeit der in Vitro –generiert BM abgeleitet DCs die Aktivierung, Verbreitung und Th1 Differenzierung der naiven CD4-T-Zellen zu modulieren. Das Protokoll dient auch dazu, die Fähigkeit der naiven CD4-T-Zellen aktiviert, induzierte zu vermehren geprüft und Th1 differenziert (Abbildung 1). Dieses vielseitige Protokoll umgeht die Unfähigkeit, speziell zu manipulieren oder die Studium Zellpopulation in rein in Vivo Protokolle auswählen. Die Auswirkungen von unterschiedlichen Molekülen und Behandlungen auf Domänencontrollern können mit BM von genetisch veränderten Mäusen5 oder durch Behandlung oder genetisch manipulieren isoliert BM Zellen9untersucht werden. T-Zell-Antworten können ebenso erkundet werden, durch den Erwerb von T-Zellen für Adoptiv-Transfer aus unterschiedlichen Quellen oder nach mehreren Manipulationen3,8,10.
Die wichtigsten Vorteile dieses Protokolls sind von zweierlei Art. T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Differenzierung der Th1 sind mit einem Flow Cytometry Ansatz analysiert; und dies wird kombiniert mit in Vivo Studien, somit Abwendung Veränderungen, die in Vitro auftreten können sowie Zelltypen und andere Faktoren, die nur in intakten Organe11gefunden.
Die Verwendung von lebenswichtigen Farbstoffen ist eine weit verbreitete Technik, Zellproliferation und vermeiden den Gebrauch von Radioaktivität zu verfolgen. Die Messung der Verbreitung mit dieser Reagenzien basiert auf Farbstoff Verdünnung nach der Zellteilung. Darüber hinaus diese Farbstoffe können bei mehreren Wellenlängen erkannt werden und sind leicht durch Durchflusszytometrie in Kombination mit mehreren fluoreszierende Antikörper oder Marker analysiert. Wir markieren die Nützlichkeit dieses Protokoll zeigt, wie die T-Zellaktivierung, Proliferation und Differenzierung der Th1 durch Durchflusszytometrie analysiert werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll ermöglicht die Charakterisierung der Kapazität der BM-abgeleitete DCs die Aktivierung, Proliferation und Differenzierung von naiven CD4-T-Zellen zu modulieren. Darüber hinaus es auch lässt sich beurteilen, die Anfälligkeit der CD4-T-Zellen zur Modulation von DCs BM abgeleitet. Mit diesem Protokoll kann Änderungen an diesen Veranstaltungen gemessenen in Vivo.
Je nach der Hypothese untersucht können mehrere Kombinationen von T-Zellen und DCs verwendet werden. Zum…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Simon Bartlett für englische Bearbeitung. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse vom Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), Miguel Servet Programm und Fundación Ramón Areces; mit Kofinanzierung von Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). Das CNIC wird unterstützt durch das Ministerium für Wirtschaft, Industrie und Wettbewerbsfähigkeit (MEIC) und der Stiftung Pro CNIC und ist ein Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). RTF ist gegründet von Fundación Ramón Areces und CNIC, VZG durch ISCIII, BHF von Instituto de Investigación Sanitaria Krankenhaus 12 de Octubre (imas12) und JMG-G von den ISCIII Miguel Servet Programm und imas12.
Materials
| Ethanol | VWR Chemicals | 20,824,365 | 5 L |
| Scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14001-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11000-13 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11253-20 | |
| Scalpel | Fine Science Tools (F.S.T.) | 10020-00 | Box of 100 blades |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA | F7524 | |
| Penicillin/streptomycin | LONZA | DE17-602E | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | GIBCO | 21875-034 | |
| Sterile Petri dishes | Falcon | 353003 | |
| 25-gauge needle | BD Microlance 3 | 300600 | |
| 1 ml syringe | Novico | N15663 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 70 μm nylon web filter | BD Falcon | 352350 | |
| Red blood lysis buffer | SIGMA | R7757 | 100 Ml |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | 100 g |
| Trypan blue | SIGMA | 302643-25G | |
| Culture-plates | Falcon | 353003 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Cambrex | BE17-737E | |
| Beta-mercaptoethanol | Merck | 8-05740-0250 | |
| Sodium pyruvate | LONZA | BE13-115E | |
| L-glutamine | LONZA | BE17-605E | |
| Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) | Prepotech | 315-03 | |
| lipopolysaccharide (LPS) | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| 96-well-plate | Costar | 3799 | |
| v450 anti-mouse CD11b antibody | BD Biosciences | 560455 | |
| PE anti-mouse CD64 antibody | BioLegend | 139303 | |
| PE anti-mouse CD115 antibody | BioLegend | 135505 | |
| FITC anti-mouse CD11c antibody | BioLegend | 117305 | |
| FITC anti-mouse MHCII antibody | BioLegend | 125507 | |
| APC anti-mouse CD86 antibody | BioLegend | 105011 | |
| APC anti-mouse CD80 antibody | BioLegend | 104713 | |
| Flow Cytometry tubes | Zelian | 300800-1 | PS 12X75 5mL |
| OTII Ovoalbumine peptide | InvivoGen | 323-339 | |
| anti-mouse biotinylated CD8α antibody | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| anti-mouse biotinylated IgM antibody | BioLegend | 406503 | |
| anti-mouse biotinylated B220 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD19 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody | BioLegend | 115302 | |
| anti-mouse biotinylated CD11b antibody | Tonbo Biosciences | 30-0112-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD11c antibody | BioLegend | 117303 | |
| anti-mouse biotinylated CD44 antibody | BioLegend | 103003 | |
| anti-mouse biotinylated CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| anti-mouse biotinylated DX5 antibody | BioLegend | 108903 | |
| streptavidin-coated magnetic microbeads | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| Magnetic cell separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | QuadroMACS Separator |
| Separation columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| PE anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100408 | |
| APC anti-mouse CD3 antibody | BioLegend | 100235 | |
| FITC anti-mouse CD8 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Cell Violet Tracer | Thermofisher | C34557 | |
| APC anti-mouse CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 anti-mouse CD69 antibody | BioLegend | 104518 | |
| PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0453 | |
| PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC anti-mouse CD45.2 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| Ionomycin | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldin A (BD GolgiPlug) | BD | 555029 | |
| Paraformaldehyde | Millipore | 8-18715-02100 | |
| Intracellular permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333 | |
| APC anti-mouse IFNg antibody | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6.SJL CD45.1 mice | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BD LSRFortessa™ Cell Analyzer | BD Biosciences | 649225 | |
| DAPI Solution | Thermofisher | 62248 |
References
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
- Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lymphocyte Polarity in Cognate Immune Cell-Cell Interactions. International Review of Cell and Molecular Biology. 327, 195-261 (2016).
- Gonzalez-Granado, J. M., et al. Nuclear envelope lamin-A couples actin dynamics with immunological synapse architecture and T cell activation. Science Signaling. 7 (322), ra37 (2014).
- Rocha-Perugini, V., Gonzalez-Granado, J. M. Nuclear envelope lamin-A as a coordinator of T cell activation. Nucleus. 5 (5), 396-401 (2014).
- Rocha-Perugini, V., et al. CD9 Regulates Major Histocompatibility Complex Class II Trafficking in Monocyte-Derived Dendritic Cells. Molecular and Cellular Biology. 37 (15), (2017).
- Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nature Reviews Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).
- Iborra, S., Gonzalez-Granado, J. M. In Vitro Differentiation of Naive CD4(+) T Cells: A Tool for Understanding the Development of Atherosclerosis. Methods in Molecular Biology. 1339, 177-189 (2015).
- Toribio-Fernandez, R., et al. Lamin A/C augments Th1 differentiation and response against vaccinia virus and Leishmania major. Cell Death & Disease. 9 (1), 9 (2018).
- Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
- Cruz-Adalia, A., et al. Conventional CD4(+) T cells present bacterial antigens to induce cytotoxic and memory CD8(+) T cell responses. Nature Communications. 8 (1), 1591 (2017).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of Visualized Experiments. (88), e51627 (2014).
- Cruz-Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacon, E. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. Journal of Visualized Experiments. (107), e52976 (2016).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584-1797 (2017).
- Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. Journal of Immunological Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animals (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral transduction of naive CD4 T cells to study Treg differentiation. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
