Summary
本文介绍了研究金阳离子 (III.) 对牛血清白蛋白的各种构象和构象依赖性独特的 bsa-Au 荧光的表征的协议。
Abstract
所提出的协议的目的是研究金 (iii) 对 bsa 的结合过程, 产生构象变化诱导红荧光 (λem = 640 nm) 的 bsa-Au (iii) 配合物。该方法调整 ph 值, 表明红荧光的出现与 BSA 构象的 ph 诱导的平衡过渡相关。红色荧光 BSA-Au (III.) 配合物只能形成与 pH 值在9.7 或以上的调整, 这对应于 "A 形" 构象的 BSA。介绍了将 BSA 调整为金摩尔比的协议, 并对金 (III.) 结合过程的时间过程进行了监测。每 BSA (III) 的最小数目, 以产生红色荧光, 小于七。我们描述了该协议的步骤, 以说明在 BSA 中存在多个 Au (III) 绑定站点。首先, 通过添加铜 (二) 或镍 (镍 (ii)) 阳离子其次为 au (iii), 这种方法揭示了一个结合点的非盟 (iii), 这不是红色荧光。其次, 通过硫醇封堵剂对 BSA 进行改性, 揭示了另一种 nonfluorophore 形成的金 (III.) 结合部位。第三, 通过对二硫化物键的劈裂和封盖改变 BSA 构象, 说明可能的 Au (III.) 结合点。该协议描述, 以控制 BSA 构象和 Au (III) 结合, 可以广泛应用于研究其他蛋白质和金属阳离子的相互作用。
Introduction
一种白蛋白-金化合物, 呈紫外 (紫外) 兴奋的红色荧光, 具有显著的斯托克斯移位, 最初是由谢等 al合成的。1. 独特和稳定的红色荧光可以在诸如传感2、3、4、成像5、6、7或纳米医学8等领域找到各种应用. ,9,10,11,12,13。近年来,14、15、16等纳米科学领域的研究人员对此化合物进行了广泛的研究。BSA-au 化合物被解释为 au25簇。所提出方法的目的是对该化合物进行详细的研究, 了解红荧光的起源。通过采用所提出的方法, 可以说明多个 au 结合点的存在, 以及荧光的起源, 替代非盟25簇的单点核。同样的方法也可以用来研究其他蛋白质17,18,19与 Au (III) 的复合物如何改变它们的内在荧光特性。
红荧光 bsa-au 化合物的合成需要对 bsa 的摩尔比 (bsa: au) 进行狭义的控制, 以最大限度地提高荧光强度和激发发射图 (EEM)20中峰值的位置。可以证明, 有多个绑定站点存在于 Au (III) 上, 包括天门冬片段 (或 Asp 片段, 在 BSA N 终点的前四个氨基酸残留物)21,22。34次氨基酸的 BSA (Cys-34) 也显示, 以协调 Au (iii) 和参与的机制, 红色荧光 ([Cys34 上限-BSA]-Au (iii))20。在裂解所有的胱氨酸-胱氨酸二硫化物键和上限所有硫醇, 红色荧光不产生 ([全硫醇上限-BSA]-Au (III))。这表明了胱氨酸-胱氨酸二硫化物键作为非盟 (III.) 结合部位产生红色荧光的必要性。
蛋白质化学技术还没有被广泛用于研究纳米科学群落中的 BSA (III.) 配合物。然而, 使用这些技术来了解这些复合体的某些方面, 以及对 BSA 中的非盟 (III) 结合点有详细的了解是很有价值的。本文旨在展示其中的一些技术。
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Protocol
1. 合成 BSA-Au (III.) 络合物
- 用1毫升高效液相色谱 (HPLC) 级水在5毫升反应瓶中溶解25毫克 BSA。
注意: 该解决方案应该看起来很清楚。 - 将金 (III) 氯化三水 (四氯金酸) 溶解于 HPLC 级水中5毫米的浓度。
注意: 该解决方案应显示为黄色。在这种浓度下制备的四氯金酸溶液将导致 BSA 的金比为1:13。- 或者, 在 HPLC 级水中制备溶液, 其浓度介于0.38 毫米 (bsa: au = 1:1) 到20毫米 (bsa: au = 1:50) 之间的四氯金酸。
注: BSA 与金的不同比值将导致激发发射图的红色荧光模式截然不同。
- 或者, 在 HPLC 级水中制备溶液, 其浓度介于0.38 毫米 (bsa: au = 1:1) 到20毫米 (bsa: au = 1:50) 之间的四氯金酸。
- 将 BSA 的反应瓶放在37摄氏度的水浴中, 用磁力搅拌器大力搅拌 750 rpm。
- 搅拌开始后立即加入1毫升的四氯金酸溶液。解决方案的颜色应从透明转换为黄色。
- 搅拌混合物2分钟在37°c 和 750 rpm 使用磁力搅拌器。
- 进入反应瓶, 添加 100 ul 1 米氢氧化钠的解决方案, 使 pH 值为12。
注: 在添加氢氧化钠后, 溶液应略微变暗至黄褐色, 然后再转回黄色。 - 继续搅拌在 750 rpm 2 小时和37摄氏度。解决方案应该慢慢地从黄色变成深黄色/褐色的颜色。这种颜色变化表明红荧光 BSA (III.) 复合物的形成。
- 允许样品在室温下坐2天, 溶液将继续变暗到琥珀色的褐色, 荧光强度会增加。
- 或者, 让样品继续搅拌37摄氏度12多 h, 因为溶液的颜色演变为琥珀色褐色。
2. 合成 BSA-铜 (II)-Au (III)
- 在1毫升的 HPLC 级水中溶解25毫克 BSA。解决方案应该看起来很清楚。
- 将氯化铜 (II) 二水合物溶解于 HPLC 级水中, 浓度为5毫米。该解决方案应显示为浅蓝色。
- 添加1毫升的水 BSA 溶液到5毫升反应瓶和地方在水浴在37°c。搅拌 750 rpm 的混合物。
- 立即在反应瓶中加入0.5 毫升氯化铜 (II) 溶液, 混合2分钟。溶液将保持浅蓝色。
- 添加 75 ul 1 米氢氧化钠, 使 pH 值为 12, 并允许混合2小时。解决方案将变为紫色。
- 将四氯金酸溶于 HPLC 级水中, 浓度为5毫米。
- 在反应瓶中加入0.5 毫升的水四氯金酸, 用1米氢氧化钠将 pH 值调整回12。
- 搅拌反应混合物2小时。
注意: 该解决方案应演变为褐色颜色。
3. 合成 BSA 镍 (II)-Au (III)
- 在1毫升的 HPLC 级水中溶解25毫克 BSA。解决方案应该看起来很清楚。
- 将氯化镍 (II) 六水合物溶于 HPLC 级水中, 浓度为5毫米。该解决方案应显示为浅绿色。
- 添加1毫升的水 BSA 溶液到5毫升反应瓶和地方在水浴在 37 oc. 搅拌混合物在 750 rpm。
- 立即在反应瓶中加入0.5 毫升氯化镍 (II) 六水合物溶液, 混合2分钟。
注: 溶液将保持浅绿色。 - 添加 75 ul 1 米氢氧化钠, 使 pH 值为 12, 并允许混合2小时。
注意: 溶液将变成深黄色。 - 将四氯金酸溶于 HPLC 级水中, 浓度为5毫米。
- 在反应瓶中加入0.5 毫升的水四氯金酸, 并将 pH 值调整回12。
- 搅拌反应混合物2小时。
注意: 该解决方案应演变为褐色颜色。
4. [Cys34]-Au (III.) 的合成
- 溶解2毫克的 n-ethylmaleimide (NEM) 在1毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS, pH 值 7.4)。
- 将2毫克的 BSA 溶于1毫升的 PBS-NEM 溶液中。
- 将溶液转移到5毫升反应瓶中, 在20摄氏度处搅拌500转1小时。
- 透析的解决方案使用 12 kDa 透析油管在500毫升的 PBS, 搅拌 50 rpm 与磁力搅拌器过夜, 以消除反应 NEM。
- 在 PBS 中溶解四氯金酸, 浓度为0.4 毫米。
注意: 解决方案将是一个微弱的黄色。 - 将反应瓶转移到37摄氏度的水浴中。搅拌750转。
- 立即加入1毫升的四氯金酸溶液的反应瓶, 并允许混合2分钟。
- 添加 75 ul 1 米氢氧化钠的反应瓶, 使 pH 值为 12, 并允许混合2小时。
5. 合成 [全硫醇上限-BSA]-Au (III.)
- 在 HPLC 级水中制备2米尿素和50毫米碳酸氢铵 (NH4HCO3, pH 8.0) 溶液。
- 在上述溶液的1毫升中溶解3.3 毫克 BSA, 并转移到5毫升反应瓶。
- 用0.25 米 (2-羧乙基) 膦 (TCEP) 的溶液, 将62.5 毫克的 TCEP 溶解在1毫升的 HPLC 水中。
- 将 TCEP 的库存溶液添加到反应瓶中, 直到 TCEP 的最终浓度为8毫米。
- 在50摄氏度的水浴中孵化溶液1小时。使用磁力搅拌器搅拌 500 rpm。
- 让溶液完全冷却到室温。
- 用1毫升的 HPLC 级水溶出12.5 毫克 NEM, 制备100毫米 NEM 的库存溶液。
- 将 NEM 的库存溶液添加到反应瓶中, 直到 NEM 的最终浓度为16毫米。
- 允许溶液结合2小时, 在20摄氏度。搅拌500转。
- 透析的解决方案使用 12 kDa 透析油管, 搅拌解决方案在 50 rpm 与磁搅拌器隔夜500毫升50毫米 NH4HCO3 , 以消除过剩的 TCEP, NEM 和尿素。
- 将反应瓶移动到37摄氏度的水浴中, 并在750转每分钟搅拌。
- 将四氯金酸溶于 HPLC 级水中, 浓度为0.66 毫米。
- 立即加入1毫升的四氯金酸溶液的反应瓶, 并允许混合2分钟。
- 加入1米氢氧化钠, 直到溶液的 pH 值为 12, 并允许溶液继续混合2小时。
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Representative Results
从 bsa-Au (III.) 络合物的荧光, 观察到, 白蛋白 (λem = 400 nm) 与红色荧光 (λem = 640 nm) 的内在蓝色荧光的转换发生在 pH 9.7 通过平衡转换 (图 1)。EEM (III.) 在不同的 bsa 到金摩尔比率如图 2所示, 这一数据表明, 改变摩尔比产生相同的发射波长在不同的激发波长。Cu (ii)、镍 (ii) 和 Au (III) 在 BSA (图 3) 竞争性地绑定到已知站点 (Asp 片段)。Cys34-capped BSA 显示了 EEM 峰值模式在 Au (III.) 结合上的变化, 这些结果显示了如何改变特定的结合点改变荧光模式。全硫醇覆盖的 BSA 显示没有红色荧光和揭示胱氨酸-胱氨酸二硫化物债券作为可能的结合点, 以产生红色荧光 (图 4)。
图1。荧光的 BSA-Au (III) 和构象诱导变化由蓝色到红色.(A) 血清白蛋白 (III.) 的吸光度和荧光 (λ前= 365 nm)。(B) 红荧光生物在 pH 值9.7 附近出现, BSA 的构象改变。(C) 当红色荧光出现时, 蓝色荧光衰减。请单击此处查看此图的较大版本.
图2。比值-米制激发-发射图 (EEM) 测量的 BSA (III.).用标准协议合成 bsa (III.) 复合物的 EEM, 同时调整 bsa 与金的比值。(A) 12 pH 值 (B) bsa: au = 1:1, (C) bsa: 非盟 = 1:7, (D) bsa: au = 1:13, (E) bsa: 非盟 = 1:26, (F) bsa: au = 一点半, (G) bsa: 非盟 = 1:40, (H) bsa: au = 1:52。请单击此处查看此图的较大版本.
图3。EEM 铜 (ii.)/镍 (ii.)-Au (III.) 配合物.励磁发射图 (励磁: 290-500 毫微米; 放射: 300-850 毫微米) bsa 与铜 (ii)/镍 (ii) 在 ph 值 12 (A和B), 与铜 (ii)/镍 (ii), 然后与金 (III) 在 ph 12 (C和D), 和吸收光谱比较 bsa, bsa, bsa-铜 (ii.)/镍 (ii) 和 bsa-铜 (ii)/镍 (ii)-金 (III) (E和F)。曲线4与曲线2和3的叠加相比较。这一数字已从迪克森, & Egusa, 美国社会学课上化学修改。140 2265-2271, (2018)。请单击此处查看此图的较大版本.
图4。EEM 的 Cys34 上限和所有硫醇上限.EEM (励磁: 300-500 nm; 发射: 300-700 nm) (A) Cys34-capped BSA 在 pH 值12上与 Au 反应。在 (B) 中, bsa 中所有的胱氨酸-胱氨酸二硫键都被劈裂, 然后在 pH 值为12时, 全硫醇上限的 bsa 与 Au 反应。这一数字已从迪克森, & Egusa, 美国社会学课上化学修改。140 2265-2271, (2018)。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在 pH 值为12的白蛋白 (III.) 化合物中制备的红色荧光在λem的发射波长 = 640 毫微米当激发与紫外 (紫外) 光λ前= 365 毫微米 (图 1A)。红色荧光的出现是一个缓慢的过程, 将需要几天在室温下增加到最大强度。在37摄氏度的反应将产生最佳的结果, 虽然更高的温度可以用来更快地产生红色荧光。蛋白质的不可逆转的退化可能发生在温度在45°c23之上。ph 值的调整使 BSA 转化为其老化 (pH > 10) 构象21 ("A 型") 对红荧光至关重要;pH 值经过精细调整, 从中性到基本, 以确定红色荧光发生的阈值 (图 1B, C)。对于最大红色荧光强度, pH 值应调整在11以上。对于红色荧光, ph 值可以调整超过 11, 虽然极其基本的 (pH > 13) 条件可以变性 BSA 和导致红色荧光消失。
改变 bsa 和 au 的化学计量比可以说明非盟对 bsa 的约束力。bsa-au (III.) 化合物的荧光光谱根据 bsa 对 au 的化学计量比率而变化 (图 2)。当 BSA 到金比被调整到 1:26, 最高在红色荧光强度被观察在λ前= 500 毫微米。另一方面, 作为 BSA: 金比率被调整到 1:7, 红色荧光主要观察在λ前= 365 毫微米。在 BSA 与 Au 的比值小于1:7 或1:52 以上时, 不能检测到红色荧光。产生红色荧光所需的金阳离子的最小数量小于7和 1, 而红色荧光损失的最大值大于 52 (图 2B, C)。此外, 所有上述样品的减少将发生在过量的硼氢化钠, 阐明所有样品仍然含有阳离子 Au (III)。此外, 额外的超过20毫米的黄金会导致溶液变得过于酸性, 变性蛋白质。如果蛋白质变性发生由于高酸度, 减少 BSA 和 Au 的浓度相对地调解这个问题。
金和其他金属阳离子对 bsa 的竞争性结合可以说明 bsa 中的结合部位。众所周知, 铜 (ii) 和镍 (ii) 都绑定到在 BSA24,25,26,27的 N 终点的 Asp 片段。通过添加铜 (II), 一个强大的粘合剂的 Asp 片段, 接着加入 Au (iii.), bsa-铜 (II)-au (iii.) 的吸光度谱和 bsa (iii.) 和 bsa-cu (ii) 的吸光度谱是相同的, 表明金和铜不在 Asp 片段上竞争相同的绑定站点 (图 3C)。镍 (ii) 弱与 Asp 片段, 因此, Au (III) 与镍 (ii) 竞争, 因为黄金增加;据观察, bsa (ii.) 和 bsa (iii.) 的吸光度谱与 bsa 镍 (ii.)-au (iii.) 不相关 (图 3F)。通过上述协议, 我们可以显示 Au (III) 如何绑定到已知的 BSA 的绑定站点。该技术还要求在11以上的 pH 值进行调整, 并通过将浓度增加两倍于 bsa, 但在半卷上进行改性, 因此应在低 BSA 到 Au 比值下进行, 以维持蛋白质构象。
修改 BSA 中的半胱氨酸残留物可以进一步阐明 Au 结合部位。金是已知有一个高亲和力的硫醇28和 BSA 拥有表面可接触的硫醇 (Cys34)21。通过这种硫醇的堵塞, 可以阐明次要结合点。这种半胱氨酸的阻断是在添加 au (iii) 到样品之前进行的, 并显示了 BSA-au (iii) 的荧光模式的改变, 表明了红色荧光机制中可能的转移通路 (图 4A)。在这种情况下, 加入硫醇阻断剂是 NEM 的, 在中性 pH 值下是必要的。裂解所有二硫化物债券和随后的上限, 其游离硫醇组显示没有红色荧光 (图 4B)。这些结果表明, 要产生一个红色荧光络合物, 需要一条二硫化物键。
我们通过使用光谱学和蛋白质化学技术, 在各种协议中展示了一种分析 BSA-Au (III.) 配合物的方法。本文介绍的蛋白质化学技术在蛋白质基纳米材料研究14中没有得到广泛的应用。这些技术可以普遍适用, 对了解金属结合过程和可能的结合点, 如胰蛋白酶, 胃蛋白酶, 溶菌酶, 和转铁蛋白17,29是很有价值的。蛋白质是动态的, 但非常精确的 "纳米材料"。对金属结合点的详细了解可以为新的基于蛋白质的材料铺平道路, 它具有控制光学特性, 具有无数的潜在应用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
东南亚承认杜克捐赠特别倡议基金, 富国法戈基金, PhRMA 基金会的支持, 以及北卡罗来纳州大学夏洛特的启动资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA), 96% | Sigma-Aldrich | A5611 | |
| gold (III) chloride trihydrate, 99.9% | Sigma-Aldrich | 520918 | |
| Copper (II) chloride dihydrate, 99.999% | Sigma-Aldrich | 459097 | |
| Nickel (II) chloride hexahydrate, 99.9% | Sigma-Aldrich | 654507 | |
| N-Ethylmaleimide (NEM), >99.0% | Sigma-Aldrich | 4259 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP), >98.0% | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Sodium hydroxide, >98.0% | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Urea, 99.5% | Chem-Implex Int'l | 30142 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Corning | MT21040CV | |
| Ammonium bicarbonate, 99.5% | Sigma-Aldrich | 9830 |
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