Summary
توفر البروتوكولات المبينة في هذا التقرير منهجية واضحة وودود لقياس البروتين للذوبان ومحتوى الكربوهيدرات (غير الهيكلية) الهضم في الأنسجة النباتية. القدرة على التحديد الكمي لهذه المغذيات النباتية اثنين الكبيرة آثار هامة للمضي قدما في مجالات فسيولوجيا النبات والبيئة الغذائية، وتفاعلات النبات العشبي والإيكولوجيا الشبكة الغذائية.
Abstract
بيانات عنصري تستخدم عادة للاستدلال على نوعية النبات كمورد لأكلات العشب. بيد أن في الزمان والمكان للكربون في الجزيئات الحيوية، ووجود المركبات الدفاعية النبات المحتوية على النتروجين، والتباين في إبلاغها الارتباطات بين النيتروجين ومصنع البروتين محتوى كل تحد دقة هذه الاستدلالات. بالإضافة إلى ذلك، ركزت البحوث على النباتات و/أو تتطلب فسيولوجيا عاشب المعمم على مستوى دقة التي لا تتحقق باستخدام الارتباطات. الأساليب المقدمة هنا نقدم الباحثين بروتوكول واضح وسريع لقياس مباشرة مصنع البروتينات القابلة للذوبان وهضم الكربوهيدرات، المغذيات الكبيرة مصنع اثنين ترتبط الأكثر ارتباطاً وثيقا بأداء الفيزيولوجية الحيوانية. البروتوكولات الجمع بين فحوصات قياس الألوان تتسم جيدا مع خطوات المحسنة الخاصة بمصنّع الهضم لتقديم نتائج دقيقة واستنساخه. لدينا تحليلات مختلفة من الذرة الحلوة الأنسجة وتظهر هذه فحوصات حساسية للكشف عن الاختلاف في مصنع البروتين للذوبان ومحتوى الكربوهيدرات القابلة الهضم عبر مستويات مكانية متعددة. هذه تشمل الاختلافات بين النباتات عبر زراعة المناطق والأنواع النباتية أو أصناف، فضلا عن داخل المحطة الاختلافات في نوع النسيج والاختلافات الموضعية حتى داخل النسيج نفسه. الجمع بين البروتين للذوبان ومحتوى الكربوهيدرات القابلة الهضم مع البيانات عنصري أيضا لديه القدرة على توفير فرص جديدة في علم الأحياء النباتية لتوصيل تغذية النبات المعدنية مع العمليات الفسيولوجية النباتية. كما تساعد هذه التحليلات توليد البروتين للذوبان والهضم الكربوهيدرات البيانات اللازمة لدراسة الإيكولوجيا التغذوية، والنبات العشبي التفاعلات والديناميات الشبكة الغذائية، مما سيعزز بدوره الفيزيولوجيا والبحوث الإيكولوجية.
Introduction
الكتلة الحيوية النباتية تشكل الأساس للشبكات الغذائية الأرضية كلها تقريبا. الحصول على العناصر الغذائية من التربة عن طريق نظم جذور النباتات والاستفادة من أشعة الشمس في أنسجتها ورقي توليف الجزيئات الحيوية. على وجه الخصوص، الكربون والنيتروجين وتستخدم لإنشاء الكربوهيدرات، البروتينات (التي تتألف من الأحماض الأمينية)، والدهون اللازمة لبناء الكتلة الحيوية النباتية (أنه ينبغي ملاحظة أن في النبات فسيولوجيا غالباً ما يشير مصطلح "macronutrient" لعناصر التربة، مثل ن، ك ف وق، ولكن في جميع أنحاء هذه الورقة هذا المصطلح سيشير إلى الجزيئات الحيوية، مثل البروتينات والكربوهيدرات والدهون). عندما آكلات العشب تستهلك المواد النباتية، المغذيات الكبيرة الواردة في الأنسجة النباتية مقسمة إلى الأجزاء المكونة لها وتستخدم بعد ذلك لقيادة العمليات الفسيولوجية للمستهلك. وبهذه الطريقة، يكون المغذيات النباتية الكبيرة تأثيراً قويا على فسيولوجيا المستهلك جنبا إلى جنب مع آثار هامة على أعلى ترتيب التفاعلات الإيكولوجية وديناميات الشبكة الغذائية.
عبر مملكة الحيوان، بروتين قابل للذوبان والهضم الكربوهيدرات هي المغذيات الكبيرة ارتباطاً أوثق ل البقاء على قيد الحياة، والاستنساخ، والأداء1. وعلاوة على ذلك، تنظم غالبية الحيوانات بنشاط استهلاكهم من هذه المغذيات الكبيرة اثنين لتلبية تلك المتطلبات الفسيولوجية1،2. هذا صحيح بصفة خاصة للحشرات آكلات العشب التي تكشف عن تركيزات السكريات والأحماض الأمينية في الأنسجة النباتية، والتي بدورها توجه سلوك التغذية. نتيجة لذلك مصنع البروتين للذوبان ومحتوى الكربوهيدرات القابلة الهضم قد لعبت دوراً قويا في تطور التفاعلات النبات-الحشرات.
بينما البيانات في مصنع البروتين للذوبان ومحتوى الكربوهيدرات القابلة الهضم نادرة نسبيا (ولكن انظر6،7،،من89،،من1011)، هناك كثرة البيانات المتاحة بشأن محتوى عنصري النبات (الكربون والنيتروجين والفوسفور). هذا إلى حد كبير بسبب عناصر الدور أساسي في محطة التغذية المعدنية3،،من45. حيث يتم قياس العناصر، الارتباطات قد استخدمت لاستخلاص كمية البروتين للذوبان والكربوهيدرات القابلة الهضم، ولكن حسابات دقيقة غالباً ما يصعب الحصول عليها. على سبيل المثال، من المستحيل استخدام الكربون كمؤشر لمحتوى الكربوهيدرات القابلة الهضم النبات لأن الكربون أوبيكويتوسلي موجودة في جميع المركبات العضوية. وجود علاقة أقوى بين عنصري النتروجين ومحتوى قابل للذوبان بروتين النبات، وغالباً ما تستخدم عوامل التحويل النيتروجين للبروتين المعمم. ومع ذلك، هناك أدلة قوية على أن التحويلات النيتروجين للبروتين يتم إبلاغها الغاية12،13،14،15، مما يجعل من المحتمل استخدام التحويل المعمم غير دقيقة. وبسبب هذا، عوامل التحويل النيتروجين للبروتين غالباً ما تفتقر إلى الدقة، لا سيما بقدر ما مطلوب للدراسات التغذوية في آكلات العشب. أيضا، وجود النبات المحتوية على ن الليلوتشيميكالس، مثل قلويدات وجلوكوسينولاتيس التي غالباً ما تكون سامة لأكلات العشب، ويمكن الخلط بين هذه التحويلات.
وهنا، نحن نقدم اثنين الاختبارات الكيميائية لقياس تركيز البروتينات القابلة للذوبان والهضم من الكربوهيدرات في الأنسجة النباتية. وترد هذه الاختبارات بشكل منفصل، ولكن يقترح أن استخدامها في نفس الوقت لتحليل العينات النباتية نفسها بغية التوصل إلى تحليل أكثر شمولاً من المغذيات النباتية الكبيرة. كلا تستخدم منهجيات مماثلة، تتألف من خطوة الاستخراج، تليها الكمي عن طريق امتصاص. مصنع عينة الإعدادية أيضا متطابقة في كلا البروتوكولين، مما يجعل من السهل لتشغيل كل التحليلات بالترادف. الأداة المساعدة لهذه الاختبارات لا تنبع من تلك الجدة، كما أنها تعتمد على كبار السن، (برادفورد، جونز، دوبوا) الراسخة فحوصات قياس الألوان16،،من1718، لكن هنا قمنا بتنظيم واضح وسهل لمتابعة البروتوكول الذي يجمع بين هذه الأساليب مع التقنيات الخاصة بمصنّع استخراج أكثر غموضاً17،19 بغية جعل تطبيق هذه الاختبارات أكثر يسرا لتلك الموجودة في الميادين ذات الصلة بالنباتات.
لكلا فحوصات، يتم استخراج المغذيات النباتية الكبيرة أولاً ماديا بالتجميد، وليوفيليزينج، وطحن المواد النباتية. مقايسة البروتين للذوبان، كذلك يتم استخراج المواد الكيميائية،من1719 من خلال عدة جولات من فورتيكسينج والتدفئة العينات في محلول هيدروكسيد الصوديوم. ثم يتم استخدام مقايسة برادفورد معروفة، الاستفادة من أخذ G-250 الأزرق الرائعة، لتحديد كمية البروتينات القابلة للذوبان والبروتينية بين 3,000 5,000 دالتونس16،17. هذا التحليل قد كشف مدى بين 1-20 ميكروغرام مجموع البروتينات الواحدة الميكروسكوبية جيدا أو < 25 ميكروغرام/مل، ولكن لا قياس الأحماض الأمينية الحرة لا. خطوة الاستخراج من مقايسة الكربوهيدرات القابلة الهضم يستند إلى أسلوب حمض مخفف سميث et al. 20 ويسمح لعزل السكريات قابل للذوبان، والنشا، وفروكتوسان – لكن الكربوهيدرات غير الهيكلية. أسلوب القياس الكمي حمض الكبريتيك فينول مأخوذ من دوبوا et al. 18 والتدابير جميع أحادية الطور، اليغو-، والسكريات (، فضلا عن المشتقات الميثيل). هذا التحليل قادراً على تحديد كمية السكريات محددة، ولكن هنا نستخدم كمؤشر لمحتوى المجموع الكربوهيدرات القابلة الهضم (انظر سميث et al. 20 لتحليل أكثر تفصيلاً). معا، هذه فحوصات قياس اثنين من المغذيات الكبيرة التي ترتبط بشدة بأداء منظمة التعاون الاقتصادي-علم وظائف الأعضاء وحركيتها، توفير البيانات الهامة على نوعية الموارد في القاعدة الأرضية في الشبكات الغذائية النباتية. عرض هذه البروتوكولات يعزز توليد مصنع macronutrient مجموعات البيانات من أجل الحصول على فهم أكثر دقة لفسيولوجيا النبات وحركيتها التغذوية الإيكولوجيا، وتفاعلات النبات العشبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-جمع وتجهيز النباتات
- جمع وتحليل عينات النبات
- وبعد جمع العينات النباتية، فلاش تجميد عينات بغمس المواد النباتية في النتروجين السائل بالملقط ومخزن في-80 درجة مئوية. إذا كان جمع عينات النبات هي كبيرة جداً لتجميد فلاش، بسرعة تبريد العينات استخدام الثلج الجاف ونقل إلى ثلاجة-80 درجة مئوية بأسرع. يمكنك تغيير محتوى المواد النباتية macronutrient بعد أن يتم فصل الأنسجة من النبات، ولذلك من المهم أن تجميد عينات النبات أسرع بعد جمع.
تنبيه: يمكن أن يسبب نيتروجين سائل قضمه الصقيع الشديد عند اتصال مع الجلد. الرجاء التأكد من نقل النيتروجين السائل في الحاويات المعتمدة وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة أثناء المعالجة، بما في ذلك البرد-قفازات، googles العين ودرع الوجه، وساحة ومعطف مختبر. - ليوفيليزي المواد النباتية باستخدام مجفف تجميد للتأكد من وجود الأنسجة أيضي نشطة بينما يتم إزالة الماء. استقرار الجاف حتى كتلة العينة لضمان إزالة جميع المياه.
- مرة العينات الجافة، وطحن إلى مسحوق ناعم باستخدام المطحنة أو الطاحونة. تخزين العينات في خزانة ديسيككاتينج حتى التحليل.
- وبعد جمع العينات النباتية، فلاش تجميد عينات بغمس المواد النباتية في النتروجين السائل بالملقط ومخزن في-80 درجة مئوية. إذا كان جمع عينات النبات هي كبيرة جداً لتجميد فلاش، بسرعة تبريد العينات استخدام الثلج الجاف ونقل إلى ثلاجة-80 درجة مئوية بأسرع. يمكنك تغيير محتوى المواد النباتية macronutrient بعد أن يتم فصل الأنسجة من النبات، ولذلك من المهم أن تجميد عينات النبات أسرع بعد جمع.
2-قابل للذوبان بروتين الإنزيم
- إعداد نموذج
- وزن عينات نسخ متماثل كل الأنسجة، كل منها حوالي 20 ملغ إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي البوليستيرين أنابيب وأنابيب التسمية. وفي وقت لاحق هذه العينات سوف يشار إليها باسم عينات غير معروفة. تسجيل الشامل الدقيق لكل عينة، كما ستحتاج هذه المعلومات لحساب % بروتين قابل للذوبان في كل عينة غير معروف. استخدام أنابيب ميكروسينتريفوجي مع أغطية التأمين، كما قد فتح الأغطية غير تأمين أثناء الخطوة اللاحقة تدفئة، مما أدى إلى فقدان عينة إلى حل.
- جعل وعزل البروتينات عينة غير معروف
- استخدام الصغرى-بيبيتور، إضافة 500 ميليلتر من 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم لكل أنبوبة. إغلاق الجفن محكم و sonicate لمدة 30 دقيقة. تسخين مياه الساخنة حمام 90 درجة مئوية.
تنبيه: هيدروكسيد الصوديوم قاعدة قوية ويمكن أن تسبب الحروق عند اتصال مع الجلد. على الرغم من أن يمثل 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم بتركيز منخفض، ارتداء قفازات واقية لتجنب تهيج الجلد. - ضع الأنابيب في رف في حمام الماء الساخن لمدة 15 دقيقة.
- الطرد المركزي أنابيب في 15,000 س ز لمدة 10 دقائق. "الماصة؛" السائل طافية في أنابيب ميكروسينتريفوجي المسمى الجديد، استخدام تلميح ماصة جديدة لكل عينة. إضافة 300 ميليلتر من 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم إلى الأنبوب الذي يحتوي على بيليه والطرد المركزي مرة أخرى في س 15,000 ز لمدة 10 دقائق. مرة أخرى، جمع السائل طافية ودمجها مع السوائل الأخرى طافية من نفس العينة. هذا احتمال وقف نقطة، وعينات يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها إذا لزم الأمر.
- استخدام الصغرى-بيبيتور، إضافة 500 ميليلتر من 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم لكل أنبوبة. إغلاق الجفن محكم و sonicate لمدة 30 دقيقة. تسخين مياه الساخنة حمام 90 درجة مئوية.
- يعجل بالبروتينات النباتية
- تحييد الرقم الهيدروجيني للحل طافية بإضافة 11 ميليلتر من 5.8 M HCl. تأكيد الرقم الهيدروجيني ~ 7 بغمس ورقة عباد الشمس في كل حل عينة.
تنبيه: حمض الهيدروكلوريك هو حمض أكال قوية التي يمكن أن تسبب الحروق عند اتصال الجلد (تطبيق الجلد أو الاستنشاق). يرجى ارتداء قفازات لمنع تهيج الجلد أثناء التعامل مع HCl. - إضافة ميليلتر 90 100% حمض التريكلوروسيتيك (TCA) لكل أنبوبة واحتضان أنابيب على الجليد لمدة 30 دقيقة. سوف تتحول ترسيب البروتينات الحل من الواضح إلى كامد. إذا لم يحدث هذا بعد 30 دقيقة، بردت الأنابيب لمدة ساعة واحدة. هذا احتمال وقف نقطة، وعينات يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها إذا لزم الأمر.
تنبيه: حمض التريكلوروسيتيك التآكل. يرجى ارتداء قفازات عند التعامل مع منع الاتصال مع الجلد وتجنب استنشاق. - عينات من أجهزة الطرد المركزي في 13,000 ز س لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. بعناية إزالة TCA طافية بالمص فإنه باستخدام خط فراغ يعلق على تلميح ميكروبيبيتي زجاج غرامة (يمكن استخدام تلميح نفسه عبر العينات). عدم الإزعاج بيليه البروتين عن طريق تجنب شفط الثقيلة والحفاظ على مسافة مناسبة بين طرف الماصة وبيليه.
- أغسل بيليه بسرعة مع 100 ميليلتر من الأسيتون-20 درجة مئوية. هذه الخطوة يزيل أي TCA المتبقية من بيليه، التي يمكن أن تتداخل مع المقايسة برادفورد اللاحقة؛ ومع ذلك، سوف تبدأ الأسيتون حل بيليه بروتين إذا ترك في الاتصال طويل جداً، لذلك ينبغي إضافة الأسيتون ثم سرعان ما يستخرج من بيليه خلال 5 ثوان.
- السماح بالأسيتون تتبخر بوضع الأنابيب في غطاء الدخان أو الثلاجة. ثم تذوب بيليه البروتين بإضافة 1 مل من هيدروكسيد الصوديوم M 0.1 لكل أنبوبة. تماما تذويب بيليه قد يتطلب عدة جولات من التدفئة بمياه الساخنة حمام، فورتيكسينج، وسونيكاتينج.
ملاحظة: يعد أنابيب الجلوس في غطاء الدخان أو الثلاجة وجفافا الكريات تحصل، أنها ستكون من أكثر صعوبة جعل إعادة. اقترح إلى جفاف بيليه لمدة 30 دقيقة، ثم قم بإلغاء الاختيار لوجود الأسيتون كل 10 إلى 15 دقيقة حتى يتم أن يتبخر الأسيتون (لا أبخرة الأسيتون قابلة للاكتشاف).
- تحييد الرقم الهيدروجيني للحل طافية بإضافة 11 ميليلتر من 5.8 M HCl. تأكيد الرقم الهيدروجيني ~ 7 بغمس ورقة عباد الشمس في كل حل عينة.
- مزيج الحلول القياسية، وتمييع حلول نموذج غير معروف، والتحديد الكمي لمحتوى البروتين الكلي للعينات غير معروف باستخدام مقايسة برادفورد.
- إعداد الأبقار الغلوبولين المناعي G (IgG) الحلول القياسية وفقا للتركيزات المدرجة في الجدول 1 (المجففة بالتبريد أو مفتش حل الأسهم يمكن أن تكون مختلطة مع المياه لتحقيق كل تركيز). تخزين المعايير عند 4 درجة مئوية. في صفيحة 96، حسنا، إضافة 160 ميليلتر لكل مفتش الحل القياسية في ثلاث بدءاً من الموضع A1 للوحة جيدا (0 ميكروغرام/ميليلتر في A1، A2، A3 الموقف، 0.0125 ميكروغرام/ميليلتر في B1, B2, B3 المواقف، إلخ).
- إعداد حل هيدروكسيد الصوديوم مخفف بإضافة 50 ميليلتر من 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم إلى 950 ميليلتر من الماء المقطر. كعنصر تحكم سلبية فارغة، إضافة 60 ميليلتر من هذا الحل إلى لوحة جيدا في ثلاث نسخ (G1, G2, G3 المواقف).
- إعداد تخفيف عينات غير معروفة بإضافة 50 ميليلتر من كل حل عينة إلى 950 ميليلتر من الماء المقطر في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل جديدة. ثم إضافة 60 ميليلتر من كل عينة المخفف للوحة جيدا في ثلاث نسخ، بدءاً من الموضع H1. ينبغي أن تسمح لوحة 96-جيدا لتحليل المعايير 6 وفارغة 1 25 عينات غير معروفة عند قراءة في ثلاث نسخ. ينبغي أن تتضمن كل لوحة جيدا بتحليل عينات قياسية وفارغة مفتش الخاصة به.
- إضافة 100 ميليلتر من الماء المقطر لجميع الآبار عينات فارغة وغير معروف. والآن كل جيدا يجب أن تحتوي على ما مجموعة 160 ميليلتر. ماصة متعدد القنوات (8 قنوات)، باستخدام إضافة 40 ميليلتر من البروتين G-250 الأزرق الرائعة أخذ صبغ إلى كل جيدا في العمود الأول من اللوحة جيدا. مزج الصبغة مع العينات بإغراق عدة مرات. كرر كافة الأعمدة الأخرى، استبدال ماصة نصائح لتجنب التلوث.
تنبيه: أخذ الرائعة G-250 الأزرق هو مهيجة وملامسة الجلد والعيون، أو ينبغي تجنب الرئتين. يرجى ارتداء قفازات لمنع ملامسة الجلد. في حالة حدوث اتصال مع الجلد، سيكون وصمة عار هذا المنتج. - استخدام إبرة لموسيقى البوب فقاعات أي موجودة في الآبار، كما أنها قد تتداخل مع قراءة جهاز المطياف الضوئي الميكروسكوبية. تنظيف الإبرة لتجنب التلوث بين الآبار. واسمحوا الميكروسكوبية احتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- استخدام جهاز المطياف الضوئي ميكروسكوبية، تسجيل قيم امتصاص لكل بئر في 595 نانومتر.
- سجل امتصاص متوسط لثلاثة آبار فارغة وطرح هذه القيمة من كل القراءات العينة القياسية وغير معروف. ثم، تسجيل امتصاص متوسط لكل نموذج قياسي وغير معروف.
ملاحظة: لحساب كمية البروتين الموجودة في كل نموذج غير معروف باستخدام المنحنى القياسي، فمن الأسهل التراجع امتصاص متوسط كل معيار ضد ميكروغرام البروتين موجودة في كل معيار، ولكن واحدة يمكن أن ارسم تركيز البروتين (μ ز/ميليلتر) لكل معيار إذا مرغوب فيه. الحسابات التالية، ومع ذلك، تشير إلى منحنى قياسي يستند ميكروغرام، لا تركيزات (ميكروغرام/ميليلتر). - مؤامرة امتصاص متوسط كل معيار ضد إجمالي كمية البروتين الموجودة في كل مستوى جيدا (الجدول 1). تناسب خط انحدار خطي لهذه البيانات، واستخدام المعادلة لحساب كمية البروتين (ميكروغرام) في كل عينة غير معروف جيدا استناداً إلى امتصاص متوسط (الشكل 1a).
ملاحظة: يجب أن يكون معامل الارتباط (قيمةr ) هذا الخط أكبر من 0.98 وروتينية قرب 0.99. سوف يكون الانحدار المعيارية الخاصة بكل لوحة، ومن ثم يجب تحليل الآبار عينة غير معروف في كل لوحة على حدة. - حالما يتم حساب متوسط كمية البروتين لكل بئر عينة غير معروف، تستخدم المعادلة التالية لحساب المبلغ الإجمالي للبروتين (ميكروغرام) في كل من العينة الأصلية:
مف = (((ثف60) x 1000)/50) * 1000
مف = ميكروغرام بروتين في العينة الأصلية
ثف = ميكروغرام بروتين في عينة غير معروف جيدا- ثم، استخدم المعادلة التالية لتحديد النسبة المئوية للبروتين في كل عينة:
فف = ((مف/1000)/Mi) * 100
فف = % البروتين في عينة
مأنا = الكتلة الأولية للعينة (mg)
ملاحظة: في بعض الحالات، قد تفوق العينة عتبة امتصاص العلوي. إذا كان الأمر كذلك، عينة حلول قد تتطلب مزيدا من التخفيف في خطوة 2.4.3.
يجب أن ثم استأثرت تخفيف إضافي في الحسابات اللاحقة. كما توفر بعض الماركات القارئ الميكروسكوبية برامج الكمبيوتر التي تقوم تلقائياً بحساب تركيز البروتين متوسط كل عينة غير معروف على أساس البيانات المنحنى المعياري.
- ثم، استخدم المعادلة التالية لتحديد النسبة المئوية للبروتين في كل عينة:
3-الهضم الكربوهيدرات بالانزيم
- إعداد نموذج
- وزن عينات نسخ متماثل كل الأنسجة، حوالي 20 ملغ، إلى زجاج 15 مل أنابيب مع قبعات مبطنة المطاط المسمار (طول 100 مم). وفي وقت لاحق هذه العينة سوف يشار إليها باسم عينات غير معروفة. تسمية أنابيب مع علامة لماء أو مع وسمها الشريط على الأغطية وتسجيل الشامل الدقيق لكل عينة، كما ستحتاج هذه المعلومات لحساب الكربوهيدرات % في كل عينة غير معروف.
- استخراج الكربوهيدرات القابلة الهضم من كل عينة غير معروف.
- أضف 1 مل من 0.1 م ح2حتى4 لكل أنبوب والأغطية اللولبية على أنابيب محكم. وضع في حمام مائي يغلي لمدة ساعة واحدة.
تنبيه: حمض الكبريتيك أكالة جداً. يرجى ارتداء القفازات، googles العين، وساحة عند التعامل مع ح2حتى4 وتنفيذ هذه الخطوة في غطاء دخان. - تهدئة الأنابيب في حمام الماء فاتر. صب محتويات الأنبوبة في المسمى 1.5 مل أنابيب ميكروسينتريفوجي (لا تقلق إذا كانت بعض النباتات بقايا المواد في أنابيب زجاجية).
- الطرد المركزي أنابيب في 15,000 س ز لمدة 10 دقائق. إزالة السائل طاف مع بيبيتور الصغيرة والمكان في أنابيب ميكروسينتريفوجي المسمى 1.5 مل جديدة. يمكن تبريد الأنابيب بين عشية وضحاها في هذه المرحلة. إذا تواصل مع المقايسة، الرجوع إلى الخطوة 3.3.2.
- أضف 1 مل من 0.1 م ح2حتى4 لكل أنبوب والأغطية اللولبية على أنابيب محكم. وضع في حمام مائي يغلي لمدة ساعة واحدة.
- مزيج الحلول القياسية والتحديد الكمي لمحتوى الكربوهيدرات القابلة الهضم مجموع عينات غير معروفة.
- إعداد D(+) الجلوكوز الحلول القياسية مع التركيزات المدرجة في الجدول 2. إعداد ست أنابيب الاختبار الزجاج مع 400 ميليلتر لكل حل القياسية.
- "الماصة؛" 15 ميليلتر من كل عينة غير معروف في أنبوبة الاختبار الخاصة به وإضافة 385 ميليلتر من الماء المقطر إلى كل من إجمالي حجم 400 ميليلتر في كل أنبوبة الاختبار. في غطاء دخان، إضافة 400 ميليلتر من الفينول 5% لكل أنبوب اختبار العينة القياسية وغير معروفة، ومن ثم بسرعة "الماصة؛" 2 مل من مركزة ح2هكذا4 في كل أنبوب. لا تلمس محتويات أنبوبة الاختبار مع طرف ماصة، فقط إضافة إلى السطح الحل (ماصة مكرر يعمل بشكل أفضل لهذا).
- اسمحوا أنابيب احتضانها لمدة 10 دقائق، ومن ثم بعناية من دوامة أنابيب لخلط المحتويات. احتضان لمدة 30 دقيقة.
تنبيه: الفينول وحمض الكبريتيك هي المهيجات المسببة للتآكل. لحماية من التعرض للجلد والعينين واستنشاق، يجب تنفيذ هذه الخطوة في غطاء الأبخرة كيميائية باستخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة، التي تشمل: تواجه نظارات العين أو درع وقفازات مطاطية وساحة المعمل، وأحذية. خلط الفينول مع حمض الكبريتيك أيضا النتائج في رد فعل الطاردة للحرارة، مما سيؤدي إلى الأنابيب تصبح ساخنة. - "الماصة؛" 800 ميليلتر من عينة من كل أنبوبة في كل من 3 البوليستيرين 1.5 مل شبه مايكرو الترعة (replicates التقنية 3 كل عينة). تعيين جهاز المطياف الضوئي لقراءة في 490 نانومتر. معايرة ومبومو فارغة تحتوي على الماء المقطر قبل قراءة المعايير أو عينات غير معروفة، وفترات متقطعة طوال قراءات عينة. من خلال جهاز المطياف الضوئي تشغيل كل ومبومو وسجل امتصاص. المتوسط عبر التقنية وإنشاء نسخ متماثلة لكل عينة غير معروف.
ملاحظة: في بعض الحالات، قد تتجاوز عينات عتبة امتصاص العلوي. إذا كان الأمر كذلك، ينبغي أن تضعف عينات في خطوة 3.2.3. ويجب أيضا استأثرت تخفيف في الحسابات اللاحقة. - حساب امتصاص متوسط لكل معيار.
ملاحظة: لحساب المبلغ الإجمالي الهضم الكربوهيدرات الموجودة في كل نموذج غير معروف باستخدام المنحنى القياسي، فمن الأسهل التراجع امتصاص متوسط كل معيار ضد ميكروغرام الجلوكوز د (+) الموجودة في كل معيار، ولكن يمكن للمرء أيضا ارسم تركيز الجلوكوز د (+) (ميكروغرام/ميليلتر) لكل معيار إذا مرغوب فيه. الحسابات التالية، ومع ذلك، تشير إلى منحنى قياسي يستند ميكروغرام، لا تركيزات (ميكروغرام/ميليلتر). - حساب المنحنى القياسي بالتآمر امتصاص متوسط ضد المبلغ الإجمالي الجلوكوز د (+) (ميكروغرام) في كل حل القياسية. تناسب خط انحدار خطي لهذه البيانات، ومن ثم استخدم المعادلة التالية لحساب إجمالي كمية الكربوهيدرات (ميكروغرام) في كل عينة غير معروف:
مج = (((س -b)/m)/(15)) * 1000
مج = ميكروغرام الكربوهيدرات في عينة
علامةx = امتصاص متوسط العينة غير معروف
ب = التقاطع y (خط الانحدار القياسي)
m = الميل (خط الانحدار القياسي)
ينبغي أن يكون معامل الارتباط لهذا الخط أكبر من 0.98 وروتينية قرب 0.99. ثم، استخدم المعادلة التالية لتحديد النسبة المئوية للكربوهيدرات في كل عينة:
فج = ((مج/1000)/(Mi)) * 100
فج = % الكربوهيدرات
مأنا = الكتلة الأولية للعينة (mg)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لإظهار مدى فائدة هذه الأساليب، قمنا بتحليل البروتينات القابلة للذوبان ومحتوى الكربوهيدرات القابلة الهضم من أربعة الميدانية المختلفة والأنسجة سويتكورن بمثابة متميزة الموارد الغذائية المحتملة للحشرات آكلات العشب. جمعنا آذان ذرة من ثلاث مناطق زراعية في الولايات المتحدة (ولاية مينيسوتا ونورث كارولينا وتكساس)، تشمل خمسة أنواع مختلفة من الذرة الحلوة (أي الأنماط الجينية) وواحدة من مجموعة متنوعة من حقل الذرة أووتجروب. ويبين الجدول 3 موجزاً لهذه العينات الذرة، وحيث تم جمعها. وقد جمعت جميع الأصناف عند النضج، ولكن نظراً للفوارق التنموية بين أصناف، أنها لم تكن كلها جمعت في نفس اليوم بعد الغرس. علينا معالجة الأذنين إلى أنسجة متميزة بفصل قشور (أوراق معدلة تحيط الكوز) بسرعة، والحرير (ألياف لامعة بين القشرة وحبات) من الإذن قبل تخزين جميع الأنسجة في-80 درجة مئوية المبين في الأساليب. ثم كان المجفف كل الأنسجة. مرة واحدة المجففة، ونحن فصل حبات من قاعدة ونصيحة من الإذن بحلق حبات من الثلث الأعلى (تلميح) وأسفل الثلث (قاعدة) الكوز. وبعد ذلك، كانت الأرض جميع الأنسجة إلى مسحوق ناعم. ثم قمنا بتحليل قشر والحرير ونواة نصيحة وعينات الأنسجة النواة الأساسية للبروتين للذوبان ومحتوى الكربوهيدرات القابلة الهضم وفقا للإجراءات المبينة في الأساليب المذكورة أعلاه. ونظرا للقيود المفروضة على كمية الأنسجة المتاحة، قمنا بتحليل ما مجموعة 217 العينات النباتية للبروتين للذوبان ومحتوى الكربوهيدرات القابلة الهضم.
بروتين قابل للذوبان
هربنا تسعة نماذج لوحات من خلال جهاز المطياف الضوئي في المجموع، والمنحنيات القياسية عموما، وارتفاع معاملات الارتباط (r)، مع القيم بين 0.985-1.00. ويبين الشكل 1 منحنى القياسية التي تم الحصول عليها مع (أ) أعلى وأدنى قيم r (ب) إبداء تقلب لاحظنا عبر لوحات. حساب % بروتين قابل للذوبان لجميع العينات باستخدام عينة أولية الجماهيري (الجدول 4)، وثم تحليل البيانات للفروق الإحصائية في محتوى البروتين للذوبان بين المناطق، وأصناف وأنواع الأنسجة. وكانت البيانات مرتبة تحول إلى مواجهة افتراضات الحالة الطبيعية عند الضرورة.
لاحظنا اختلافات كبيرة في محتوى البروتين للذوبان بين المناطق (ولش ANOVA؛ و(2، 133.5) = 4.303، P = 0.015)، كما حللت لاحقاً نتيجة لذلك، البيانات من كل منطقة على حدة. مينيسوتا العينات أظهرت وجود تفاعل كبير بين مجموعة متنوعة ونوع الأنسجة على محتوى البروتين للذوبان (ANOVA ثنائي الاتجاه؛ و(3، 64) = 16.51، ف < 0.001). كان معظم أنسجة مماثلة قابل للذوبان بروتين المحتوى في كل الأصناف، باستثناء قاعدة حبات، حيث يتضمن متنوعة الذرة الحلوة ما يقرب من 7 إضعاف المبلغ مقارنة بتنوع حقل الذرة. لتنوع حقل الذرة (سينجينتا/ناغورني كاراباخ-3122A-لوبيز)، قشور والحرير كانت مماثلة ومحتوى البروتين للذوبان أدنى من جميع الأنسجة. حبات من طرف الإذن كان أعلى من البروتين للذوبان، وحبات من قاعدة الإذن كانت متوسطة (الشكل 2a). لتنوع الذرة الحلوة (بروفيدانس ذو لونين)، كانت جميع أنسجة متميزة، مع قشور والحرير التي تحتوي على أقل من البروتين للذوبان، وحبات قاعدة الوارد ~2.5 مرات أكثر من تلميح حبات (الشكل 2).
ولاية كارولينا الشمالية عينات أظهرت أيضا وجود تفاعل كبير بين متنوعة ونوع الأنسجة (ANOVA ثنائي الاتجاه؛ و(3، 77) = 3.33، ف < 0.024). أظهرت معظم أنسجة مماثلة من البروتين للذوبان المحتوى عبر أصناف، باستثناء حبات تلميح التي تعرض محتوى أعلى في غير-بريتيش تيليكوم متنوعة (حلوة G90 الهجين). بريتيش تيليكوم كانت قشور متنوعة (سيدوي بريتيش تيليكوم 1576) الأنسجة مع أدنى البروتين للذوبان المحتوى، تليها الحرير وحبات تلميح، الذي كان على محتوى مماثل. حبات قاعدة كان أعلى من البروتين للذوبان، لكن لم تكن تختلف إحصائيا لنصيحة حبات (الشكل 2 (ج)). في غير-بريتيش تيليكوم المتنوعة (حلوة G90 الهجين)، كانت جميع أنسجة متميزة باستثناء تلميح وحبات الأساسية التي إحصائيا مماثلة. وكان قشور أدنى البروتين للذوبان المحتوى، تليها الحرير، وحبات نصيحة والقاعدة التي كان محتوى أعلى (الشكل 2d).
تكساس العينات أظهرت اختلافات كبيرة في محتوى البروتين للذوبان بين أصناف (ANOVA ثنائي الاتجاه؛ و(1، 76) = 12.91، P = 0.001) والأنسجة (ANOVA ثنائي الاتجاه؛ و(3، 76) = 21.90، ف < 0.001)، ولكن لا يوجد تفاعل هام (ANOVA ثنائي الاتجاه؛ و(3، 76) = 0.436، P = 0.728). عموما، متنوعة ذو لونين (Sh2 SS2742 نات الثالث) أظهرت انخفاض محتوى متوسط من بروتين لذوبان من تنوع "الملكة الفضة" (TRTD F1 (سو)). عبر كل أصناف، قشور كان أقل محتوى البروتين، وتليها الحرير، وثم تلميح وقاعدة حبات، اللذين كان المثل المحتوى عالية (الشكل 2e-f).
الهضم من الكربوهيدرات
لأنه تم تحليل جميع العينات في وقت واحد، ونحن فقط ركض منحنى قياسي واحد. ويبين الشكل 1 ج أن معامل الارتباط مرتفع، في 0.998. ونحن حساب محتوى الكربوهيدرات القابلة الهضم % لجميع العينات (الجدول 5) وثم تحليل البيانات الإحصائية الاختلافات في محتوى الكربوهيدرات القابلة الهضم بين المناطق، وأصناف وأنواع الأنسجة. البيانات مرتبة-تحولت عند الضرورة للوفاء بافتراضات الحياة الطبيعية.
لا توجد هناك فروق كبيرة بين المناطق (ANOVA؛ و(2، 216) = 1.47، P = 0.231)، ولكن من أجل الاستمرارية مع التحليلات البروتين نحن مرة أخرى تحليل البيانات من كل منطقة على حدة. مينيسوتا العينات أظهرت لا اختلافات كبيرة في محتوى الكربوهيدرات القابلة الهضم بين أصناف (ANOVA ثنائي الاتجاه؛ و(1، 64) = 0.00014، P = 0.990) أو نوع الأنسجة (ANOVA ثنائي الاتجاه؛ و(3، 64) = 0.818، P = 0.489). وكان هناك أيضا أي تفاعل كبير بين مجموعة متنوعة والأنسجة (ANOVA ثنائي الاتجاه؛ و(3، 64) = 2.26، P = 0.092). الشكل 2 ألف ب- يبين أن جميع الأنسجة معارضها متوسط محتوى من 36.5% (± 0.53).
أظهرت عينات كارولاينا الشمالية أثر كبير من نوع النسيج في محتوى الكربوهيدرات القابلة الهضم (ANOVA ثنائي الاتجاه؛ و(3، 77) = 3.99، P = 0.011)، لكن أي تأثير متنوعة (ANOVA ثنائي الاتجاه؛ و(1، 77) = 1.06, P = 0.307) أو تفاعل (ANOVA ثنائي الاتجاه؛ و(3، 77) = 0.465، P = 0.708). الشكل 2 (ج) -د تبين أن الحرير كان أقل محتوى الكربوهيدرات القابلة الهضم، تليها قشور، تلميح حبات، وحبات قاعدة. جميع أنسجة مماثلة إحصائيا فيما عدا الحرير وحبات قاعدة.
تكساس العينات أظهرت أي تأثير هامة متنوعة (ANOVA ثنائي الاتجاه؛ و(1، 76) = 0.834، P = 0.364) أو نوع الأنسجة (ANOVA ثنائي الاتجاه؛ و(3، 76) = 1.03، P = 0.385)، ولكن تظهر وجود تفاعل كبير (ANOVA ثنائي الاتجاه؛ و(3، 76) = 3.34، P = 0.024). كان هذا التأثير إلى حد كبير لأن حبات قاعدة في تنوع ذو لونين (Sh2 SS2742 نات الثالث) في أعلى بكثير من الكربوهيدرات القابلة لهضم المحتوى من تلك في تنوع "الملكة الفضة" (TRTD F1 (سو)). الشكل 2e و يظهر أن هناك لا اختلافات إحصائية في محتوى الكربوهيدرات القابلة الهضم عبر أنواع الأنسجة في تنوع "الملكة الفضة" (TRTD F1 (سو))، ولكن كان هناك فارق كبير بين الحرير والأنسجة النواة الأساسية ل (ذو لونين متنوعة ثالثا نات Sh2 SS2742).
رقم 1. المنحنيات القياسية لفحوصات macronutrient. (أ) المنحنى القياسي مقايسة البروتين للذوبان عرض اللوحة مع معامل الارتباط الأعلى (منحنى أفضل). (ب) المنحنى القياسي مقايسة البروتين للذوبان عرض اللوحة مع أدنى معامل الارتباط (منحنى أسوأ). (ج) المنحنى القياسي للمقايسة الكربوهيدرات القابلة الهضم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. يعني % بروتين قابل للذوبان ومحتوى الكربوهيدرات القابلة الهضم % بالنسبة لكل نوع من أنواع الأنسجة. (أ) MN-- بريتيش تيليكوم سينجينتا/ناغورني كاراباخ-3122A-لوبيز (حقل الذرة)، مينيسوتا (ب) -غير-بريتيش تيليكوم بروفيدانس ذو لونين، 1576 (ج) سيدوي نورث كارولاينا-- بريتيش تيليكوم ، (د) NC-غير-بريتيش تيليكوم الحلو G90 الهجين، (ه) TX-Sh2 SS2742 F1 نات الثالث ذو لونين، (و) تكساس-الفضة الملكة TRTD F1 (سو). الدوائر تظهر البيانات الخام، بينما تظهر المربعات في قيم المتوسط الحسابي. الأخضر (قشر)، الأحمر (الحرير)، والأصفر (تلميح حبات)، والأرجواني (قاعدة حبات). منقط-خطوط الاتصال الأصل لكل مربع إظهار نسبة P:C لكل الأنسجة (نسبة هو الميل لخط منقط). إظهار رسائل نتائج الوظائف المخصصة للاختلافات البروتين على طول الاختلافات أعلى والكربوهيدرات على طول الجانب، مع رسائل مختلفة تمثل القيم تختلف اختلافاً كبيرا عبر الأنسجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| مفتش تركيز (ميكروغرام/uL) | البروتين في "عينات قياسية" (ug) |
| 0.0000 | 0 |
| 0.0125 | 2 |
| 0.0250 | 4 |
| 0.0375 | 6 |
| 0.0500 | 8 |
| 0.1000 | 16 |
الجدول 1- الحسابات المنحنى المعياري مقايسة البروتين للذوبان. يتم حساب كمية البروتين في كل معيار بأخذ تركيز كل معيار، وضرب من قبل كمية الحل القياسية في كل بئر (160 ميليلتر).
| د (+) الجلوكوز تركيز (ميكروغرام/uL) | الجلوكوز د (+) في "عينات قياسية" (ug) |
| 0.0000 | 0 |
| 0.0375 | 15 |
| 0.0750 | 30 |
| 0.1125 | 45 |
| 0.1500 | 60 |
| 0.1875 | 75 |
الجدول 2. حساب المنحنى المعياري للمقايسة الكربوهيدرات الهضم. يتم حساب كمية الجلوكوز في كل معيار بأخذ تركيز كل معيار، وضرب من قبل كمية قياسية الحل في كل أنبوبة الاختبار (400 ميليلتر).
| المنطقة | متنوعة | موقع | N |
| مينيسوتا | بريتيش تيليكوم سينجينتا/ناغورني كاراباخ-3122A-لوبيز (حقل الذرة) | روسيماونت، مينيسوتا (44.7070،-93.1073) | 10 |
| غير--"بريتيش تيليكوم بروفيدانس ذو لونين" | روسيماونت، مينيسوتا (44.7070،-93.1073) | 10 | |
| كارولاينا الشمالية | غير "بريتيش تيليكوم الحلو G90 الهجين" | روكي ماونت، نورث كارولاينا (35.8918،-77.6780) | 10 |
| بريتيش تيليكوم سيدوي 1576 | إدينتون، كارولاينا الشمالية (36.1758،-76.7057) | 10 | |
| تكساس | Sh2 SS2742 F1 نات الثالث ذو لونين | لوبوك، تكساس (33.6935،-101.8249) | 10 |
| فضة الملكة TRTD F1 (سو) | لوبوك، تكساس (33.6935،-101.8249) | 10 |
الجدول 3. ملخص الموقع أخذ عينات الذرة والأصناف- لكل تركيبة المنطقة ومتنوعة، وآذان 10 جمعت وحللت الأنسجة الأربعة: قشر والحرير وحبات نصيحة وحبات قاعدة.
| المنطقة | متنوعة | % بروتين قابل للذوبان | |||
| قشر | الحرير | نصيحة النواة | النواة الأساسية | ||
| مينيسوتا | بريتيش تيليكوم سينجينتا/ناغورني كاراباخ-3122A-لوبيز (حقل الذرة) | 3.29 ± 0.38 | 4.57 ± 1.27 | 14.74 ± 1.54 | 7.07 ± 0.84 |
| غير--"بريتيش تيليكوم بروفيدانس ذو لونين" | 3.35 ± 0.58 | 6.71 ± 0.70 | 17.87 ± 3.85 | 48.41 ± 2.85 | |
| كارولاينا الشمالية | غير "بريتيش تيليكوم الحلو G90 الهجين" | 2.90 ± 0.60 | 6.97 ± 0.63 | 12.95 ± 0.86 | 12.23 ± 0.83 |
| بريتيش تيليكوم سيدوي 1576 | 5.48 ± 0.73 | 9.08 ± 0.62 | 10.75 ± 0.93 | 12.76 ± 1.16 | |
| تكساس | Sh2 SS2742 F1 نات الثالث ذو لونين | 7.74 ± 1.03 | 12.15 ± 0.63 | 14.79 ± 0.69 | 14.88 ± 0.48 |
| فضة الملكة TRTD F1 (سو) | 6.06 ± 1.05 | 8.17 ± 0.79 | 12.95 ± 1.19 | 12.32 ± 1.23 | |
الجدول 4. يعني قيم البروتين لكل نوع المنطقة ومتنوعة، والأنسجة. يعني تظهر النسب المئوية (حسب الكتلة الجافة) ± 1 سراج الدين.
| المنطقة | متنوعة | الكربوهيدرات القابلة الهضم % | |||
| قشر | الحرير | نصيحة النواة | النواة الأساسية | ||
| مينيسوتا | بريتيش تيليكوم سينجينتا/ناغورني كاراباخ-3122A-لوبيز (حقل الذرة) | 37.55 ± 0.88 | 32.31 ± 1.38 | 36.79 ± 1.60 | 38.66 ± 1.57 |
| غير--"بريتيش تيليكوم بروفيدانس ذو لونين" | 37.30 ± 0.82 | 37.31 ± 2، 30 | 35.80 ± 1.77 | 34.83 ± 1.37 | |
| كارولاينا الشمالية | غير "بريتيش تيليكوم الحلو G90 الهجين" | 35.79 ± 0.81 | 35.28 ± 1.17 | 36.13 ± 0.91 | 39.47 ± 1.18 |
| بريتيش تيليكوم سيدوي 1576 | 35.75 ± 0.58 | 34.91 ± 0.76 | 35.73 ± 1.35 | 37.29 ± 1، 13 | |
| تكساس | Sh2 SS2742 F1 نات الثالث ذو لونين | 35.55 ± 0.87 | 33.40 ± 1.10 | 34.85 ± 1.01 | 39.14 ± 1.22 |
| فضة الملكة TRTD F1 (سو) | 34.63 ± 1، 13 | 33.42 ± 2.33 | 35.16 ± 1.16 | 33.93 ± 1.03 | |
الجدول 5. يعني القيم الكربوهيدرات لكل نوع المنطقة ومتنوعة، والأنسجة. يعني تظهر النسب المئوية (حسب الكتلة الجافة) ± 1 سراج الدين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
عن طريق الجمع بين فحوصات اللونية راسخة مع البروتوكولات الفعالة الخاصة بمصنّع استخراج، توفير فحوصات أثبتت هنا طريقة معقولة ودقيقة لقياس البروتين النباتية القابلة للذوبان ومحتوى الكربوهيدرات القابلة الهضم. نتائج استخدام الذرة كأنموذج يوضح كيف يمكن استخدام هذه البروتوكولات للحصول على قياسات دقيقة عبر مختلف مستويات مكانية بيولوجيا ذات الصلة. على سبيل المثال، تمكنا من الكشف عن الاختلافات في مصنع البروتين للذوبان ومحتوى الكربوهيدرات القابلة الهضم بين أنواع الأنسجة المناطق أو أصناف (أو الأنماط الجينية)، الجغرافية، والأنسجة المعزولة حتى مكانياً. كلا فحوصات يمكن القيام به باستخدام المشتركة معدات المختبرات والمواد الكاشفة، التي تتطلب المهارات المختبرية الأساسية فقط، ويمكن تحليل عدد كبير نسبيا من العينات (50-75) في إطار زمني قصير.
على الرغم من أن من السهل نسبيا لتنفيذ، بعض الخطوات هي أكثر أهمية من البعض الآخر، وإذا فعلت بشكل غير صحيح يمكن أن تحد من دقة النتائج. على سبيل المثال، من الضروري أن تعالج المواد النباتية بشكل صحيح أثناء مرحلة أخذ العينات. الأنسجة النباتية حتى تشريح ستظل أيضي نشطة حتى تتعرض لدرجة حرارة قاتلة، وخلال هذه الفترة النبات يمكن تغيير محتوى macronutrient. نتيجة لذلك فترات زمنية طويلة بين النبات أخذ العينات وتجميد (أما عن طريق تخزين N أو الثلاجة السائل) يمكن أن تزيد من احتمال أن عينة مصنع macronutrient المحتوى قد لا يعكس المحتوى الذي كان حاضرا وقت أخذ العينات.
2.3.3-2.3.5 الخطوات في البروتوكول البروتين تكتسي أهمية خاصة للتوصل إلى نتيجة ناجحة، كما تتعامل هذه الخطوات مع البروتينات سرع. ويجب الحرص على تجنب فقدان أي من بيليه البروتين عند كنس TCA طافية من أنابيب ميكروسينتريفوجي، لأن ذلك سيؤدي التقليل محتوى البروتين. من المهم أيضا عند غسل بيليه بروتين مع الأسيتون للقيام بذلك بسرعة كبيرة. يمكن أن تتحلل الأسيتون بيليه إذا تركت في الاتصال لأكثر من بضع ثوان. نقترح الحد من الاتصال بين الأسيتون وبيليه إلى أقل من 5 ثوان. وأخيراً، عند تجفيف بيليه، المهم أن تأخذ الرعاية للسماح فقط بما يكفي من الوقت الأسيتون تتبخر. إذا ترك بيليه الجاف لفترة طويلة جداً، فإنه يصبح من الصعب جداً ريسوسبيند في هيدروكسيد الصوديوم. ونحن نقترح تجفيف بيليه لمدة 30 دقيقة ومن ثم التحقق من وجود الأسيتون، بمراقبة بصريا السائل في الأنبوب أو عن طريق الكشف بدقة عن رائحة أبخرة الأسيتون. متابعة التدقيق بيليه كل 10-15 دقيقة حتى يتبخر الأسيتون.
كما هو مبين في برادفورد عام 197616، الخطوات القياس الكمي باستخدام صبغة G-250 الأزرق الرائعة أخذ السماح لحساسية عالية، مع انحراف المعياري للبروتين فقط 5 ميكروغرام/مل والاستقرار المعقدة عالية البروتين-صبغ وتدخل محدود من قبل المركبات غير البروتين. هذا التحليل قد كشف مدى بين 1-20 ميكروغرام مجموع البروتينات الواحدة الميكروسكوبية جيدا (مقايسة تركيزات منخفضة) أو بحد أقصى 25 ميكروغرام/مل؛ ومع ذلك، ينبغي أن تضعف أي تركيز يتجاوز أعلى مستوى وإعادة تحليل للنتائج الأكثر دقة (البروتوكول ينتج فائض في الحل في حالة لا بد من تخفيف هذه وتحليل جديد). هناك تحيز لصبغ لربط تفضيلي للأحماض الأمينية الأساسية، مثل ارجينين، ومخلفات الأحماض الأمينية العطرية؛ ومع ذلك، يظل المقايسة برادفورد الأسلوب الأكثر دقة وسهلة الاستخدام لتقدير مجموع البروتين في عينات مختلطة.
تحليل الكربوهيدرات القابلة الهضم هو طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة وبسيط لتحديد كمية السكريات النباتية مع استبعاد الكربوهيدرات الهيكلية (مثل السيلولوز)، التي يتم الهضم بمعظم آكلات العشب. وتعتبر الخطوات الأكثر إشكالية في فحوصات الكربوهيدرات خطوات 3.2.1 و 3.3.2-3.3.4. هنا، من المهم للحفاظ على أنابيب تستقيم وتشديد screwcaps جيدا عند الغليان، كالأخذ بأي المياه سوف يؤدي إلى تمييع عينات وتؤثر على دقة القياس الكمي. أيضا، يجب أن تؤخذ عند العمل مع الفينول الرعاية وتركيز حامض الكبريتيك، حيث أنهما أكالة جداً. تجدر الإشارة إلى أن ندعو إلى تسجيل امتصاص العينة في 490 نيوتن متر، وهو امتصاص الحد الأقصى هيكسوسيس، ولكن لا السكريات الأخرى، مثل بينتوسيس والأحماض أورونيك لها امتصاص الحد أقصى في 480 نانومتر20،21. بالنسبة لمخاليط السكر في عينات النبات، 490 نانومتر ويوفر الطول موجي مناسب لتحديد كمية الكربوهيدرات عموما المحتوى22،،من2324، ولكن لإجراء تحليل أكثر تفصيلاً للسكريات المختلفة انظر20، 21. وينبغي أيضا أن يلاحظ أن ماسوكو et al. 23 يوفر طريقة ميكروسكوبية مبسطة لتحليل الكربوهيدرات حمض الكبريتيك الفينول.
هو أسلوب آخر ملحوظ لتقدير النبات محتوى المغذيات25،،من2627 القريبة من الأشعة تحت الحمراء الطيفي (التقارير). وتستخدم تكنولوجيا التقارير على نطاق واسع في الزراعة وإنتاج الأغذية. هذا الأسلوب البديل هو موسع، وغير تدميري ويأخذ جزء من الوقت الذي يتطلبه أي أسلوب كيمياء رطبة، ويمكن تطبيقها على مستويات مختلفة من المناظر الطبيعية وصولاً إلى قطعة منفردة من الأنسجة النباتية. هذا الأسلوب تدابير المغذيات غير مباشر ويعتمد على قياسات دقيقة كيمياء رطبة للمادة الكيميائية النباتية من الفائدة للمعايرة. ولذلك سيكون الأساليب الموصوفة هنا مكاناً حاسما في المستقبل لتحليل المغذيات النباتية، ضمان أن المعايرة استناداً إلى التقدير الكمي macronutrient القابلة للذوبان والهضم وغير متحيزة بالأمهات البديلات عنصري غير الغذائية.
عرض الأساليب لقياس البروتين النباتية القابلة للذوبان ومحتوى الكربوهيدرات القابلة الهضم آثار كبيرة للعلوم البيئية والبيولوجية. وعلى الرغم من ثروة معلومات عن تكوين عنصري من أنسجة النبات، شدة تفتقر إلى معلومات عن مصنع macronutrient المحتوى. ونظرا للقيود القائمة في ربط تدابير عنصري مع macronutrient المحتوى، وإذ تعترف بالعلاقة القوية بين النباتات الغذائية المحتوى وأعلى ترتيب العمليات الإيكولوجية، الحصول على هذا النوع من البيانات أمر ضروري النهوض بمجالات فسيولوجيا النبات، الإيكولوجيا التغذوية، والتفاعلات بين النبات العشبي، الشبكة الغذائية ديناميات11،28،،من2930. وهو أملنا في أن تقديم منهجية واضحة وودود لقياس البروتين النباتية القابلة للذوبان ومحتوى الكربوهيدرات القابلة الهضم ستشجع الباحثين على جمع ودمج هذا النوع من البيانات في البحوث في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وبفضل كل ما لدينا من المتعاونين الذين ساعدوا مع مجموعات حقل الذرة الحلوة، بما في ذلك ريسيج دومينيك وموت دان في جامعة ولاية كارولينا الشمالية، وبات بورتر في جامعة تكساس أية آند أم في لوبوك، تكساس. شكرا على كليسولد فيونا للمساعدة على تحسين البروتوكولات وتوفير عمليات التحرير على هذه المخطوطة. هذا العمل كان تدعمها جزئيا في تكساس أية & م قاد جيم سلاير الزمالات الدراسية (قسم علم الحشرات) والتكنولوجيا الحيوية خطر التقييم برنامج منح تنافسية منح رقم 2015-33522-24099 من "وزارة الزراعة في الولايات المتحدة" (منحت للغاز و STB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microplate reader (spectrophotometer) | Bio-Rad | Model 680 XR | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent concentrate | Bio-Rad | #5000006 | 450mL |
References
- Simpson, S. J., Raubenheimer, D. The Nature of Nutrition: A Unifying Framework from Animal Adapation to Human Obesity. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (2012).
- Behmer, S. T.
- Epstein, E. Mineral nutrition of plants: mechanisms of uptake and transport. Annual Review of Plant Physiology. 7 (1), 1-24 (1956).
- Chapin, F. S. III The mineral nutrition of wild plants. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 11 (1), 233-260 (1980).
- Marschner, H. Marschner's Mineral Nutrition of Higher Plants. , Academic press. London, UK. (1956).
- Stieger, P. A., Feller, U. Senescence and protein remobilization in leaves of maturing wheat plants grown on waterlogged soil. Plant and Soil. 166, 173-179 (1994).
- Li, R., Volenec, J. J., Joern, B. C., Cunningham, S. M. Seasonal changes in nonstructural carbohydrates, protein, and macronutrients in roots of alfalfa, red clover, sweetclover, and birdsfoot trefoil. Crop Science. 36, 617-623 (1996).
- Sánchez, E., Rivero, R. M., Ruiz, J. M., Romero, L. Changes in biomass, enzymatic activity and protein concentration in roots and leaves of green bean plants (Phaseolus vulgaris L. cv. Strike) under high NH4NO3 application rates. Scientia Horticulturae. 99, 237-248 (2004).
- Lenhart, P. A., Eubanks, M. D., Behmer, S. T. Water stress in grasslands: Dynamic responses of plants and insect herbivores. Oikos. 124, 381-390 (2015).
- Machado, A. R., Arce, C. C. M., Ferrieri, A. P., Baldwin, I. T., Erb, M. Jasmonate-dependent depletion of soluble sugars compromises plant resistance to Manduca sexta. New Phytologist. 207, 91-105 (2015).
- Deans, C. A., Behmer, S. T., Fiene, J., Sword, G. A. Spatio-temporal, genotypic, and environmental effects of plant soluble protein and digestible carbohydrate content: implications for insect herbivores with cotton as an exemplar. Journal of Chemical Ecology. 42 (11), 1151-1163 (2016).
- Boisen, S., Bech-Andersen, S., Eggum, B. O. A critical view of the conversion factor 6.25 from total nitrogen to protein. Acta Agriculturae Scandinavica. 37, 299-304 (1987).
- Seed protein contents and nitrogen-to-protein conversion factors for some uncultivated tropical plant seeds. Food Chemistry. Ezeagu, I. E., Petzke, J. K., Metges, C. C., Akinsoyinu, A. O., Ologhobo, A. D. 78, 105-109 (2002).
- Izhaki, I. Influence of nonprotein nitrogen on estimation of protein from total nitrogen in fleshy fruits. Journal of Chemical Ecology. 19, 2605-2615 (1993).
- Mossé, J. Nitrogen to protein conversion factor for ten cereals and six legume or oilseeds. A reappraisal of its definition and determination. Variation according to species and seed protein content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 38, 18-24 (1990).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Jones, C. G., Hare, J. D., Compton, S. J. Measuring plant protein with the Bradford assay. Journal of Chemical Ecology. 15 (3), 979-992 (1989).
- Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colormetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Biochemistry. 28, 350-358 (1956).
- Clissold, F. J., Sanson, G. D., Read, J. The paradoxical effects of nutrient ratios and supply rates on an outbreaking insect herbivore, the Australian plague locust. Journal of Animal Ecology. 75, 1000-1013 (2006).
- Smith, D., Paulsen, G. M., Raguse, C. A. Extraction of total available carbohydrates from grass and legume tissue. Plant Physiology. 39 (6), 960-962 (1964).
- Cui, S. W. Food carbohydrates: Chemistry, physical properties, and applications. , CRC Press. Boca Raton, FL, USA. (2005).
- Chow, P. S., Landhäusser, S. M. A method for routine measurements of total sugar and starch content in woody plant tissues. Tree Physiology. 24 (10), 1129-1136 (2004).
- Masuko, T., Minami, A., Iwasaki, N., Majima, T., Nishimura, S. I., Lee, Y. C. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format. Analytical Biochemistry. 339 (1), 69-72 (2005).
- Foley, W. J., McIlwee, A., Lawler, I., Aragones, L., Woolnough, A. P., Berding, N. Ecological applications of near infrared reflectance spectroscopy- a tool for rapid, cost-effective prediction of the composition of plant and animal tissues and aspects of animal performance. Oecologia. 116 (3), 292-305 (1998).
- Kokaly, R. F. Investigating a physical basis for spectroscopic estimates of leaf nitrogen concentration. Remote Sensing of Environment. 75 (2), 153-161 (2001).
- Schulz, H., Baranska, M. Identification and quantification of valuable plant substances by IR and Raman spectroscopy. Vibrational Spectroscopy. 43 (1), 13-25 (2007).
- Cozzolino, D., Morón, A. The potential of near-infrared reflectance spectroscopy to analyse soil chemical and physical characteristics. The Journal of Agricultural Science. 140, 65-71 (2003).
- Simpson, S. J., Sword, G. A., Lorch, P. D., Couzin, I. D. Cannibal crickets on a forced march for protein and salt. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4152-4156 (2006).
- Lihoreau, M., Buhl, J., Sword, G. A., Raubenheimer, D., Simpson, S. J. Nutritional ecology beyond the individual: a conceptual framework for integrating nutrition and social interactions. Ecology Letters. 18 (3), 273-286 (2015).
- Deans, C. A., Behmer, S. T., Tessnow, A., Tamez-Guerra, P., Pusztai-Carey, M., Sword, G. A. Nutrition affects insect susceptibility to Bt. Scientific Reports. 7, 39705 (2017).
