Quantificare la pianta proteina solubile e digeribile carboidrati contenuti, utilizzando mais (Zea mays) As an Exemplar
Summary
I protocolli descritti nel presente documento forniscono una metodologia chiara e accessibile per la misurazione della proteina solubile e digeribile (non strutturali) carboidrati contenuti nei tessuti vegetali. La capacità di quantificare questi macronutrienti due pianta ha implicazioni significative per far progredire i campi di fisiologia vegetale, ecologia nutrizionale, interazioni pianta-erbivoro ed ecologia alimentare-web.
Abstract
Dati elementari sono comunemente usati per dedurre la qualità della pianta come una risorsa per gli erbivori. Tuttavia, l’ubiquità del carbonio in biomolecole, la presenza di composti difensive vegetali contenenti azoto e variazione nelle specie-correlazioni tra pianta e azoto contenuto proteico tutti limitare l’accuratezza di queste illazioni. Inoltre, ricerca focalizzata sulla pianta e/o fisiologia erbivoro richiedono un livello di precisione che non viene raggiunto utilizzando generalizzato correlazioni. I metodi qui presentati offrono ai ricercatori un protocollo chiaro e rapido per misurare direttamente proteine solubili vegetali e carboidrati digeribili, i macronutrienti due pianta più strettamente legati alle prestazioni fisiologiche degli animali. I protocolli combinano analisi colorimetriche ben caratterizzate con passaggi ottimizzato specifico impianto digestione per fornire risultati precisi e riproducibili. Le nostre analisi di granturco dolce diverso tessuti mostrano che queste analisi hanno la sensibilità per rilevare la variazione nella pianta proteina solubile e contenuto di carboidrati digeribili attraverso più scale spaziali. Questi comprendono le differenze tra pianta attraverso varietà e specie vegetali o regioni in crescita, così come all’interno-pianta differenze nel tipo di tessuto e anche posizionali all’interno del tessuto stesso. Combinazione di proteina solubile e contenuto di carboidrati digeribili con dati elementari ha anche il potenziale per fornire nuove opportunità in biologia vegetale per collegare la nutrizione minerale delle piante con processi fisiologici delle piante. Queste analisi hanno anche contribuiscono a generare la proteina solubile e dati di carboidrati digeribili dovuti studiare ecologia nutrizionale, interazioni pianta-erbivoro e cibo-web dinamiche, che a sua volta migliorerà la fisiologia e ricerca ecologica.
Introduction
Biomassa vegetale costituisce la base di praticamente tutte le reti alimentari terrestri. Piante acquisiscono elementi nutritivi dal terreno tramite i loro sistemi di radici e utilizzano la luce solare nei loro tessuti fogliari di sintetizzare biomolecole. In particolare, carbonio e azoto vengono utilizzati per creare i carboidrati, proteine (composto da aminoacidi) e lipidi che sono necessari per costruire la biomassa vegetale (dovrebbe essere notato che in fisiologia che il termine “dei macronutrienti” spesso si riferisce a elementi del terreno, ad esempio N, vegetale P, K e S, tuttavia, in tutta questa carta questo termine farà riferimento a biomolecole, come proteine, carboidrati e lipidi). Quando erbivori consumano materiale vegetale, i macronutrienti contenuti nei tessuti vegetali sono suddivisi nelle loro parti costituenti e quindi utilizzati per guidare i processi fisiologici del consumatore. In questo modo, i macronutrienti pianta hanno una forte influenza sulla fisiologia dei consumatori con le implicazioni importanti per interazioni ecologiche di più alti ordine e cibo-web dinamiche.
In tutto il Regno animale, proteina solubile e carboidrati digeribili sono i macronutrienti più strettamente legati alla sopravvivenza, riproduzione e prestazioni1. Inoltre, la maggior parte degli animali regola attivamente la loro assunzione di questi due macronutrienti per soddisfare le loro esigenze fisiologiche1,2. Ciò è particolarmente vero per gli insetti erbivori che rilevano le concentrazioni di zuccheri e aminoacidi nei tessuti vegetali, che a sua volta indirizza il comportamento alimentare. Di conseguenza, pianta proteina solubile e contenuto di carboidrati digeribili ha svolto un ruolo forte nell’evoluzione delle interazioni pianta-insetto.
Mentre i dati sulla pianta proteina solubile e contenuto di carboidrati digeribili sono relativamente rari (ma Vedi6,7,8,9,10,11), c’è una preponderanza di dati disponibili sul contenuto elementare pianta (carbonio, azoto e fosforo). In gran parte questo è perché gli elementi svolgono un ruolo primario nella pianta nutrizione minerale3,4,5. Dove gli elementi sono misurati, le correlazioni sono state utilizzate per estrapolare la quantità di proteina solubile e carboidrati digeribili, ma calcoli accurati sono spesso difficili da ottenere. Per esempio, è Impossibile utilizzare il carbonio come un indicatore del contenuto di carboidrati digeribili pianta perché il carbonio è ubiquitariamente presente in tutti i composti organici. Esiste una relazione più forte tra azoto elementare e contenuto di proteina solubile di pianta, e fattori di conversione generalizzati azoto / proteine sono spesso utilizzati. Tuttavia, c’è forte evidenza che le conversioni di azoto / proteine sono altamente specie-12,13,14,15, rendendo probabile l’uso di conversione generalizzato imprecise. Per questo motivo, fattori di conversione dell’azoto / proteine spesso mancano di precisione, particolarmente per quanto è necessario per gli studi nutrizionali erbivori. Inoltre, la presenza di N-contenente pianta allelochemicals, come alcaloidi e glucosinolati che spesso sono tossici per gli erbivori, può confondere queste conversioni.
Qui, vi offriamo due analisi chimiche per misurare la concentrazione di proteine solubili e carboidrati digeribili nei tessuti vegetali. Queste analisi sono presentate separatamente, ma è suggerito che essi essere utilizzati contemporaneamente per analizzare i campioni di pianta stessa al fine di realizzare un’analisi più completa dei macronutrienti pianta. Entrambi utilizzano metodologie simili, costituito da una fase di estrazione, seguita da quantificazione tramite assorbanza. Preparazione di campioni di pianta anche è identico per entrambi i protocolli, che lo rende facile da eseguire entrambe le analisi in tandem. L’utilità di questi test non deriva da loro novità, come si affidano più anziani, (Bradford, Jones, Dubois) consolidata saggi colorimetrici16,17,18, ma qui abbiamo organizzato una chiara e facile da seguire protocollo che unisce questi metodi con più oscuri estrazione impianto specifiche tecniche17,19 al fine di rendere l’applicazione di questi saggi più accessibile a coloro nei campi rilevanti per la pianta.
Per entrambi i dosaggi, pianta macronutrienti prima vengono estratti fisicamente da congelamento, liofilizzazione e macinazione del materiale vegetale. Per il dosaggio di proteina solubile, ulteriore estrazione chimica è fatto17,19 attraverso diverse fasi di agitazione e riscaldamento campioni in soluzione di NaOH. L’analisi di Bradford ben noto, utilizzando G-250 di blu brillante Coomassie, viene quindi utilizzato per quantificare le proteine solubili e polipeptidi tra 3.000-5.000 Dalton16,17. Questo test ha un range tra 1-20 µ g di proteine totali per micropiastra bene o < 25 µ g/mL, ma non misura non acidi amminici liberi. La fase di estrazione del dosaggio dei carboidrati digeribili si basa sul metodo acido diluito di Smith et al. 20 e consente per l’isolamento di zuccheri solubili, amido e fructosan – ma carboidrati non strutturali. Un metodo di quantificazione di acido solforico fenolo è preso da Dubois et al. 18 e misura tutti i mono-, oligo- e polisaccaridi (nonché derivati metile). Questo test è in grado di quantificare gli zuccheri specifici, ma qui lo usiamo come un indicatore del contenuto totale di carboidrati digeribili (Vedi Smith et al. 20 per un’analisi più dettagliata). Insieme, questi saggi misurano i due macronutrienti che sono fortemente legati per prestazioni eco-fisiologia ed erbivoro, fornendo dati importanti sulla qualità della risorsa alla base delle catene alimentari terrestri delle piante. Presentando questi protocolli promuove la generazione dei DataSet dei macronutrienti pianta al fine di ottenere una comprensione più approfondita della fisiologia vegetale, ecologia nutrizionale erbivoro e interazioni pianta-erbivoro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Combinando analisi colorimetriche ben consolidate con protocolli efficace impianto specifico dell’estrazione, le analisi hanno dimostrate qui forniscono un metodo ragionevole e preciso per la misurazione della proteina solubile vegetale e contenuto di carboidrati digeribili. I nostri risultati utilizzando mais come exemplar illustra come questi protocolli possono essere utilizzati per ottenere misurazioni precise tra diverse scale spaziali biologicamente rilevanti. Ad esempio, siamo stati in grado di rilevare differenze …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Grazie a tutti i nostri collaboratori che hanno assistito con raccolte di campi di mais dolce, tra cui Dominic Reisig e Dan Mott alla North Carolina State University e Pat Porter alla Texas A & M University a Lubbock, TX. Grazie a Fiona Clissold per aiutare ad ottimizzare i protocolli e per fornire le modifiche apportate a questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da Texas A & M C. Everette Stancapiano Fellowship (Department of Entomology) e il programma di sovvenzione di valutazione biotecnologia rischio competitivo concedere no. 2015-33522-24099 dal dipartimento di agricoltura degli Stati Uniti (assegnato a GAS e STB).
Materials
| microplate reader (spectrophotometer) | Bio-Rad | Model 680 XR | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent concentrate | Bio-Rad | #5000006 | 450mL |
References
- Simpson, S. J., Raubenheimer, D. . The Nature of Nutrition: A Unifying Framework from Animal Adapation to Human Obesity. , (2012).
- Behmer, S. T. Insect herbivore nutrient regulation. Annual Review of Entomology. 54, 165-187 (2009).
- Epstein, E. Mineral nutrition of plants: mechanisms of uptake and transport. Annual Review of Plant Physiology. 7 (1), 1-24 (1956).
- Chapin, F. S. The mineral nutrition of wild plants. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 11 (1), 233-260 (1980).
- Marschner, H. . Marschner’s Mineral Nutrition of Higher Plants. , (1956).
- Stieger, P. A., Feller, U. Senescence and protein remobilization in leaves of maturing wheat plants grown on waterlogged soil. Plant and Soil. 166, 173-179 (1994).
- Li, R., Volenec, J. J., Joern, B. C., Cunningham, S. M. Seasonal changes in nonstructural carbohydrates, protein, and macronutrients in roots of alfalfa, red clover, sweetclover, and birdsfoot trefoil. Crop Science. 36, 617-623 (1996).
- Sánchez, E., Rivero, R. M., Ruiz, J. M., Romero, L. Changes in biomass, enzymatic activity and protein concentration in roots and leaves of green bean plants (Phaseolus vulgaris L. cv. Strike) under high NH4NO3 application rates. Scientia Horticulturae. 99, 237-248 (2004).
- Lenhart, P. A., Eubanks, M. D., Behmer, S. T. Water stress in grasslands: Dynamic responses of plants and insect herbivores. Oikos. 124, 381-390 (2015).
- Machado, A. R., Arce, C. C. M., Ferrieri, A. P., Baldwin, I. T., Erb, M. Jasmonate-dependent depletion of soluble sugars compromises plant resistance to Manduca sexta. New Phytologist. 207, 91-105 (2015).
- Deans, C. A., Behmer, S. T., Fiene, J., Sword, G. A. Spatio-temporal, genotypic, and environmental effects of plant soluble protein and digestible carbohydrate content: implications for insect herbivores with cotton as an exemplar. Journal of Chemical Ecology. 42 (11), 1151-1163 (2016).
- Boisen, S., Bech-Andersen, S., Eggum, B. O. A critical view of the conversion factor 6.25 from total nitrogen to protein. Acta Agriculturae Scandinavica. 37, 299-304 (1987).
- Ezeagu, I. E., Petzke, J. K., Metges, C. C., Akinsoyinu, A. O., Ologhobo, A. D. Seed protein contents and nitrogen-to-protein conversion factors for some uncultivated tropical plant seeds. Food Chemistry. 78, 105-109 (2002).
- Izhaki, I. Influence of nonprotein nitrogen on estimation of protein from total nitrogen in fleshy fruits. Journal of Chemical Ecology. 19, 2605-2615 (1993).
- Mossé, J. Nitrogen to protein conversion factor for ten cereals and six legume or oilseeds. A reappraisal of its definition and determination. Variation according to species and seed protein content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 38, 18-24 (1990).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Jones, C. G., Hare, J. D., Compton, S. J. Measuring plant protein with the Bradford assay. Journal of Chemical Ecology. 15 (3), 979-992 (1989).
- Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colormetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Biochemistry. 28, 350-358 (1956).
- Clissold, F. J., Sanson, G. D., Read, J. The paradoxical effects of nutrient ratios and supply rates on an outbreaking insect herbivore, the Australian plague locust. Journal of Animal Ecology. 75, 1000-1013 (2006).
- Smith, D., Paulsen, G. M., Raguse, C. A. Extraction of total available carbohydrates from grass and legume tissue. Plant Physiology. 39 (6), 960-962 (1964).
- Cui, S. W. . Food carbohydrates: Chemistry, physical properties, and applications. , (2005).
- Chow, P. S., Landhäusser, S. M. A method for routine measurements of total sugar and starch content in woody plant tissues. Tree Physiology. 24 (10), 1129-1136 (2004).
- Masuko, T., Minami, A., Iwasaki, N., Majima, T., Nishimura, S. I., Lee, Y. C. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format. Analytical Biochemistry. 339 (1), 69-72 (2005).
- Foley, W. J., McIlwee, A., Lawler, I., Aragones, L., Woolnough, A. P., Berding, N. Ecological applications of near infrared reflectance spectroscopy- a tool for rapid, cost-effective prediction of the composition of plant and animal tissues and aspects of animal performance. Oecologia. 116 (3), 292-305 (1998).
- Kokaly, R. F. Investigating a physical basis for spectroscopic estimates of leaf nitrogen concentration. Remote Sensing of Environment. 75 (2), 153-161 (2001).
- Schulz, H., Baranska, M. Identification and quantification of valuable plant substances by IR and Raman spectroscopy. Vibrational Spectroscopy. 43 (1), 13-25 (2007).
- Cozzolino, D., Morón, A. The potential of near-infrared reflectance spectroscopy to analyse soil chemical and physical characteristics. The Journal of Agricultural Science. 140, 65-71 (2003).
- Simpson, S. J., Sword, G. A., Lorch, P. D., Couzin, I. D. Cannibal crickets on a forced march for protein and salt. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4152-4156 (2006).
- Lihoreau, M., Buhl, J., Sword, G. A., Raubenheimer, D., Simpson, S. J. Nutritional ecology beyond the individual: a conceptual framework for integrating nutrition and social interactions. Ecology Letters. 18 (3), 273-286 (2015).
- Deans, C. A., Behmer, S. T., Tessnow, A., Tamez-Guerra, P., Pusztai-Carey, M., Sword, G. A. Nutrition affects insect susceptibility to Bt. Scientific Reports. 7, 39705 (2017).
