PCR quantitativo do bacteriófago T7 de Biopanning
Summary
Um tempo, preciso e reprodutível quantitativo PCR (qPCR) método eficiente para enumerar do bacteriófago T7 é descrito aqui. O protocolo descreve claramente a preparação de DNA genômica do fago, preparação de reação de PCR, qPCR ciclismo condições e análise de dados de qPCR.
Abstract
Este protocolo descreve o uso do PCR quantitativo (qPCR) para enumerar fago T7 de experimentos de seleção do fago (i.e., “biopanning”). qPCR é uma abordagem baseada em fluorescência para quantificação de DNA, e aqui, é adaptado para quantificar o genoma do fago como um proxy para as partículas do fago. Neste protocolo, um método de preparação do ADN do fago facile é descrito usando o aquecimento de alta temperatura sem purificação de DNA adicional. O método só precisa de pequenos volumes do fago tratado termicamente e pequenos volumes da reação qPCR. qPCR é alta produtividade e rápido, capaz de processar e obter dados de uma placa de 96 poços de reações em 2-4 h. comparado a outras abordagens de enumeração do fago, qPCR é mais eficiente em termos de tempo. Aqui, qPCR é usado para enumerar fago T7 identificado de biopanning contra o modelo de muco da fibrose cística, como in vitro . O método de qPCR pode ser estendido para quantificar o fago T7 de outros experimentos, incluindo outros tipos de biopanning (ex., triagem de fago imobilizou o emperramento da proteína, in vivo ) e outras fontes (por exemplo, sistemas de água ou fluidos corporais). Em resumo, este protocolo pode ser modificado para quantificar qualquer vírus DNA encapsulado.
Introduction
Tecnologia de exibição do bacteriófago (fago), desenvolvida por George Smith em 1985, é uma abordagem poderosa, elevado-throughput para identificar peptídeos ou proteínas ligantes contra alvos ou receptores da membrana celular, organelas celulares, antígenos da doença ou específicos órgãos e tecidos nas últimas duas décadas1,2. Aqui, bibliotecas aleatórias de polipeptídeos ou anticorpos de cadeia única são exibidas sobre as proteínas do casaco do fago (tipicamente M13 ou T7) e ligantes específicos podem ser identificados de garimpar contra proteínas imobilizadas em vitro ou in vivo sistemas biológicos, através de um processo de seleção iterativa. Então, ligantes podem ser acoplados com agentes terapêuticos ou de imagem para diagnóstico e tratamento de doenças3,4. É fundamental para enumerar com precisão o fago durante várias etapas de biopanning: (1) para quantificar o fago que ligam-se ao substrato e (2) para quantificar o fago para determinar se há enriquecimento com cada rodada de seleção (enriquecimento do fago indica biopanned afinidade do fago para o destino). O atual padrão de ouro para quantificação, ensaio de chapa de dupla camada, apresenta vários desafios; é tedioso, complexos e potencialmente impreciso para um grande número de amostras. Portanto, nosso grupo desenvolveu um método de (qPCR) reação em cadeia de polimerase quantitativo sensível, reprodutível, precisos e tempo-eficiente para enumerar as partículas do fago M13 e T7 de biopanning5.
qPCR é um método atraente e viável quantificar com precisão o fago T7 e M13. Desde que cada partícula individual do fago pode conter apenas uma cópia do DNA genômico (dsDNA ou ssDNA), um genoma do fago é equivalente a uma partícula fago; quantificando o número de genomas do fago, é possível quantificar o número de fago. Durante qPCR, repórter fluorescente corantes ligam o DNA genômico do fago não especìfica ou especificamente por meio de cartilhas específicas durante a amplificação por PCR e a fluorescência sinal aumenta com cada rodada de amplificação. Quando o sinal de fluorescência atinge o limite, que rodada/ciclo da amplificação é conhecido como o ciclo de limiar (Ct). As concentrações conhecidas de referência do fago DNA são plotadas contra seus valores de Ct para estabelecer uma curva padrão. Usando a curva padrão com os valores de Ct de amostras de DNA, as concentrações do fago podem ser interpoladas.
Enquanto inúmeras estratégias foram anteriormente desenvolvidas e usadas extensivamente para quantificar o fago de biopanning, cada um deles tem desafios específicos. O método mais popular e convencional é o ensaio da chapa de dupla camada. Aqui, o anfitrião bactérias estão infectadas com fago preparado em diluições em série, são banhadas em um substrato sólido ágar e são revestidas com ágar; fagos são enumerados com o número de placas formado (ou seja, placa formando unidades ou pfu) na placa de ágar. Ensaio de placa é sensível mas tedioso, demorado e impreciso, especialmente para numerosas amostras e com altas concentrações de5. Além disso, ensaios imunoenzimático (ELISA) foram adaptados para enumerar M13 e T7 fago partículas6,7,8. Aqui, o fago em diferentes diluições é vinculado e capturado em um substrato sólido (ou seja, uma microplaca), sondado com anticorpos específicos do fago e detectados por meio de repórteres (por exemplo, enzima sensível cromogênico substratos, fluorophores) para Determine o número de partículas do fago presentes. As leituras (por exemplo, fluorescência, absorbância) das amostras podem ser usadas para quantificar as concentrações desconhecidas contra normas do fago em concentrações conhecidas. Diferentes baseados no fago ELISAs têm sido desenvolvidas, mas têm limitações potenciais. Um grupo desenvolveu um sanduíche em papel ELISA com uma gama de quantificação que durou sete ordens de magnitude (102-109 pfu/mL); no entanto, esse método necessárias várias etapas de revestimento de anticorpo e levou para um dia inteiro para o ensaio de8. Nosso grupo também desenvolveu um método de ELISA para quantificar as partículas de fago M13, mas tinha um intervalo de detecção menos sensível do 106 a de pfu/mL 1011 5. Lantanídios comutável sondas de fluorescência foram desenvolvidas para enumerar M13 e dados de quantificação podem ser obtidos dentro de 20 min; no entanto, este ensaio tem uma estreita faixa dinâmica de 109 1012 pfu/mL9. Um grupo usado microscopia de força atômica para enumerar as partículas de fago M13 em solução, mas isso requer avançados de microscopia eletrônica e trabalhou apenas dentro de uma faixa estreita de concentrações10. Outro estudo usado monodisperso emulsões para prender fluorescente fago M13 e T4 do repórter e contar fago pelo número de gotículas fluorescentes; no entanto, esta abordagem também exibiu uma gama estreita de quantificação de 102 a 10 de pfu/mL6 11. Enquanto gotículas que digital PCR tem sido utilizada para quantificar o fago M13, esta abordagem é incapaz de diferenciar entre o número de partículas de fago infecciosas e não infecciosas12.
O nosso grupo desenvolveu recentemente qPCR métodos para enumerar fago T7 e M13 identificado de biopanning contra um modelo de célula barreira sangue – cérebro usando dois diferentes repórter fluorescente tinturas5. Em comparação com métodos de quantificação acima mencionados, os métodos de qPCR desenvolvemos foram elevado-throughput e tempo-eficiente para quantificar numerosas amostras e capaz de diferenciar entre fago infeccioso e não infecciosas com DNase eu pré-tratamento da amostras do fago. Importante, esta abordagem pode reproducibly e precisão quantificar bacteriófagos M13 e T7 de biopanning amostras. Para orientar pesquisadores novatos na área do fago qPCR, aqui descrevemos um método de qPCR detalhadas para enumerar as partículas do fago T7 de uma biblioteca de cisteína-restrita (CX7C) garimpadas contra uma barreira de muco de fibrose cística (CF) em vitro . Partir deste trabalho, método de qPCR pode ser estendido para quantificar as partículas do fago de outros tipos de biopanning e de outras fontes, incluindo água, solo e fluidos corporais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desenvolvemos métodos de qPCR para quantificação de DNA genômico do fago5, e aqui descrevemos e adaptou um método de qPCR para enumerar fago T7 selecionado contra uma barreira de muco tipo CF. Informações mínimas para diretrizes de publicação do quantitativo real-time PCR experimentos (MIQE) foram adaptados para desenvolver e validar o método de qPCR para enumeração de T7 fago15. O protocolo que desenvolvemos para quantificar o fago de experimentos biopanning ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por PhRMA Foundation Research Grant Starter e nacional do coração, pulmão e Instituto de sangue do institutos nacionais da saúde concedem sob número prêmio R01HL138251.
Materials
| Materials and reagents | |||
| Primers for T7 genomic DNA | IDT | F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT |
|
| T7Select packaging control DNA | EMD Millipore | 69679-1UG | |
| MicroAmp optical 96-well reaction plate | ThermoFisher Scientific | N8010560 | |
| qPCR master mix–Power up SYBR Green master mix | Applied biosystems | A25742 | |
| MicroAmp optical adhesive film kit | ThermoFisher Scientific | 4313663 | |
| T7Select 415-1 Cloning Kit | EMD Millipore | 70015 | User protocols : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP |
| DNase I solution | ThermoFisher Scientific | 90083 | |
| 24-well transwell plate | Corning | 3472 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled H2O | Invitrogen | 10977015 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | Corning | 21040CV | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| ViiA7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block | ThermoFisher Scientific | 4453535 | |
| Heraeus Pico 21 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002415 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| HERMO SCIENTIFIC Multi-Blok Heater | ThermoFisher Scientific | Model:2001 | |
| Sorvall Legend X1 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004220 | |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoFisher Scientific | 75003624 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| QuantStudio Real-time PCR software | ThermoFisher Scientific | v1.2 | |
| Real-time qPCR primer design | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT |
References
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