Summary
Qui, presentiamo un protocollo per la cultura tridimensionale delle cellule di glioblastoma paziente-derivato all'interno di biomateriali ortogonalmente sintonizzabile progettate per imitare la matrice di cervello. Questo approccio fornisce un in vitro, una piattaforma sperimentale che mantiene molte caratteristiche in vivo delle cellule di glioblastoma in genere perdite nella cultura.
Abstract
Glioblastoma (GBM) è il più comune, ancora più letale, il cancro del sistema nervoso centrale. Negli ultimi anni, molti studi si sono concentrati su come la matrice extracellulare (ECM) dell'ambiente unico cervello, come l'acido ialuronico (HA), facilita l'invasione e la progressione di GBM. Tuttavia, la maggior parte dei modelli in vitro cultura includono cellule di GBM all'esterno del contesto di un ECM. Murini xenotrapianti di cellule di GBM sono utilizzati comunemente come pure. Tuttavia, in vivo modelli rendono difficile isolare i contributi delle singole caratteristiche del microambiente tumorale complesso comportamento del tumore. Qui, descriviamo una piattaforma di base di idrogel, tridimensionale (3D) cultura HA che permette ai ricercatori di alterare in modo indipendente rigidità e concentrazione dell'HA. Ad alto peso molecolare HA e polietilenglicole (PEG) comprendono gli idrogel, che sono reticolate tramite aggiunta di Michael-tipo in presenza di cellule vive. Idrogel 3D culture della paziente-derivato GBM cellule Mostra vitalità e proliferazione prezzi buono come o meglio di, quando coltivate come standard gliomaspheres. Il sistema di idrogel permette inoltre di incorporazione di peptidi ECM-mimetici per isolare gli effetti delle interazioni cellula-ECM specifici. Idrogeli sono otticamente trasparenti in modo che le cellule vive possono essere imaged in 3D cultura. Infine, HA idrogel culture sono compatibili con le tecniche standard per analisi molecolari e cellulari, tra cui PCR, Western blotting e cryosectioning seguita da immunofluorescenza.
Introduction
Sistemi tridimensionali (3D) cultura ricapitolano le interazioni tra cellule e loro circostante matrice extracellulare (ECM) nei tessuti nativi meglio di loro bidimensionale (2D) controparti1,2. Avanzamenti nell'ingegnerizzazione del tessuto hanno prodotto piattaforme di cultura sofisticata, 3D che consentono indagini controllate in fisiche e chimiche 1) come componenti di matrice microambiente effetto cella comportamenti e 2) l'efficacia di nuovo terapeutico strategie per un certo numero di malattie, compreso i cancri2. Mentre in vitro modelli non possono rappresentare fattori sistemici, quali i segnali di sistema endocrini e sistema immunitario e non possono quindi sostituire completamente in vivo modelli, essi offrono numerosi vantaggi tra cui riproducibilità, controllo sperimentale, convenienza e velocità. Qui, descriviamo l'uso del cervello-mimetici idrogeli in quale 3D culture di cellule di tumore cerebrale derivata da paziente catturano molti aspetti della fisiologia del tumore, in particolare, la dinamica di acquisizione trattamento resistenza3. Rispetto ad altri metodi in vitro , queste culture meglio rappresentano modelli di tumore in vivo e osservazioni cliniche3.
Glioblastoma (GBM) è il tumore più frequente e letale originari del cervello, con una sopravvivenza mediana di soltanto 1-2 anni4,5. Negli ultimi anni, molti studi si sono concentrati sull'influenza dell'ambiente di matrice tumorale in GBM6,7,8. L'unico cervello ECM è stata segnalata per influenzare la resistenza terapeutica6,7,8,9,10,11 , proliferazione e migrazione delle cellule GBM , 12. acido ialuronico (HA) è un abbondanti glicosaminoglicani (GAG) nel cervello, dove interagisce con altre GAGs e proteoglicani per formare un idrogel-come mesh13. Molti studi hanno riferito HA sovraespressione in tumori GBM e suoi effetti successivi il cancro progressione8,9,13,14,15,16 ,17. Altri componenti della MEC colpiscono anche GBM tumore crescita e l'invasione6,7,15,18. Ad esempio, fibronectina e vitronectina, che in genere sono iperespressi in GBM, indurre eterodimerizzazione di recettori di superficie delle integrine tramite l'associazione alla sequenza "RGD" e avviare complesse cascate di segnalazione che favoriscono la sopravvivenza del tumore19 ,20,21. Oltre alle influenze biochimiche, proprietà fisiche della matrice del tessuto anche influenzare GBM progressione22,23.
Continua acquisizione di resistenza alle terapie è uno dei principali driver di GBM letalità4. Farmaci promettenti risultati in modelli 2D o gliomasphere hanno fallito in successivi studi sugli animali e casi clinici3, che indica che gli effetti di fattori microambientali contribuito notevolmente al GBM tumore risposta1. Mentre modelli animali possono fornire un 3D, fisiologicamente appropriato microambiente per xenotrapiantati paziente cellule e generare risultati clinicamente rilevanti24,25, la complessità del cervello microambiente in vivo rende difficile per stabilire quali funzionalità, incluse le interazioni cellula-matrice, sono risultati biologici chiave specifica. Identificazione di nuovi bersagli terapeutici apprezzeranno l'uso di piattaforme di cultura semplificato in cui sono definite le proprietà biochimiche e biofisiche.
A differenza dei modelli precedentemente segnalati biomateriale del GBM microambiente tumorale26,27 , che non hanno raggiunto un vero controllo ortogonale su singole caratteristiche biochimiche e fisiche della ECM, la piattaforma di biomateriale qui segnalati consente il disaccoppiamento dei contributi delle diverse funzioni indipendenti per fenotipo delle cellule GBM. Qui, presentiamo un sistema basato su HA, ortogonalmente sintonizzabile, idrogel per 3D cultura di cellule GBM derivanti dal paziente. Idrogeli sono formati da due componenti del polimero: HA 1) biologicamente attivo e 2) biologicamente inerte polietilenglicole (PEG). PEG è un materiale biocompatibile e idrofilo ampiamente usato con adsorbimento di proteine basso e immunogenicità minimo28. Qui, circa il 5% di moiety acido glucuronico sulle catene di HA sono funzionalizzate con gruppi tiolici per abilitare reticolazione a un commercialmente disponibili 4-braccio-PEG è terminato con le maleimidi via l'aggiunta di Michael-tipo. Nella sua forma più comune nel corpo, HA esiste in catene ad alto peso molecolare (HMW). Qui, un basso grado di modificazione di HMW HA (500-750 kDa) aiuta a preservare interazioni natali di HA e suoi recettori cellulari, tra cui CD4429. Sostituendo il PEG-tiolo per HA-tiolo, mantenendo un costante rapporto molare dei tioli totali per le maleimidi, HA concentrazione può essere separato da proprietà meccaniche nel caso degli idrogeli risultante. Inoltre, stechiometrici controlli possono essere utilizzati per coniugato peptidi cisteina-terminato a un numero definito di medio di terminazione maleimide braccia su ogni 4-braccio-PEG. Incorporazione di peptidi ECM-derivato, adesivi consente interazioni con le integrine su cellule in coltura, attraverso il quale segnali biochimici e chimici sono trasdotte1. Aggiunta di maleimide-tiolo si verifica molto rapidamente in condizioni fisiologiche, riducendo al minimo il tempo necessario per incapsulamento cella e massimizzare sopravvivenza delle cellule derivate dal paziente. Inoltre, idrogel culture possono essere trattate come esemplare tipico del tessuto e sono compatibili con tecniche di caratterizzazione standard tra cui il Western blotting, citometria a flusso e immunofluorescenza. Il seguente protocollo descrive le procedure per la realizzazione di idrogeli, instaurazione 3D delle colture di cellule GBM derivate da paziente e tecniche per l'analisi biochimica.
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Protocol
Tutti i tessuti umani raccolta punti sono stati effettuati sotto protocolli istituzionalmente approvati.
1. Thiolation di acido ialuronico
Nota: Rapporti molari sono indicati rispetto al numero totale di gruppi carbossilato, se non diversamente specificato.
- Sciogliere 500 mg di ialuronato di sodio (HA, 500-750 kDa) a 10 mg/mL in acqua distillata, demineralizzata (DiH2O) in autoclave sterilizzato, beuta da 250 mL. Agitare la soluzione (~ 200 giri/min) a temperatura ambiente per 2 ore a sciogliere completamente HA. Utilizzare un ancoretta e piastra magnetica per mantenere reazione mescolando durante thiolation procedura.
- Utilizzando 0,1 M di acido cloridrico (HCl), regolare il pH della soluzione HA a 5.5. Pesare 69,6 mg (0.25 x rapporto molare) di 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC).
Nota: Sebbene non disciolto EDC può essere aggiunto direttamente alla soluzione HA, è in genere più facile da sciogliere prima EDC in 1 mL di DiH2O e quindi aggiungere rapidamente la soluzione EDC per la soluzione HA. Pre-dissoluzione in 1 mL di DiH2O può essere fatto anche con N-Idrossisuccinimide (NHS) e cistamina dihydrocholoride prima di aggiungere la reazione ai punti 1.3 e 1.4. - Aggiungere 17,9 mg (0.125 x rapporto molare) di NHS alla reazione. Regolare il pH della soluzione di reazione a 5.5 utilizzando 0.1 M HCl e incubare la reazione a temperatura ambiente per 45 minuti.
- Aggiungere 70,0 mg (0.25 x rapporto molare) di cystamine dihydrochloride nella soluzione di reazione. Utilizzare 0,1 M di idrossido di sodio (NaOH) per aggiustare il pH a 6.25. Incubare la reazione a temperatura ambiente durante la notte mentre si mescolano.
- Il giorno seguente, è possibile utilizzare 1 M NaOH per regolare il pH della soluzione di reazione a circa 8. Aggiungere 192 mg (4 x rapporto molare) di ditiotreitolo (DTT) alla reazione. Regolare il pH torna a 8 dopo l'aggiunta del DTT e lasciare sotto agitazione per 1-2 ore a temperatura ambiente.
- Utilizzare 1 M HCl per aggiustare il pH a 4. Trasferire la miscela di reazione intera in membrana di dialisi pre-impregnati (cut-off di peso molecolare intorno 13 kDa) e Dializzare contro DiH2O pre-regolata a pH 4.
Nota: Il volume di DiH2O per dialisi deve essere almeno 40 volte il volume della soluzione HA reagito (ad es., campione di 50 mL in 2 L di DiH2O, pH 4). - Sostituire la soluzione di dialisi (DiH2O, pH 4) due volte al giorno per 3 giorni a temperatura ambiente.
- Filtrare la soluzione dializzata attraverso una membrana da 0,22 µm, filtro vuoto-driven. Flash freeze soluzione dei chitosani HA in azoto liquido. Utilizzare un liofilizzatori per congelare i campioni a secco oltre 2 giorni. Chitosani HA in forma secca possono essere memorizzato in un essiccatore sottovuoto a-20 ° C per almeno 6 mesi.
- Per determinare il grado di thiolation, utilizzare test di Ellman e/o proton NMR spettroscopia30,31.
2. preparazione dei materiali di reticolazione
- Sciogliere chitosani HA alla concentrazione desiderata (in questo esempio, 13,3 mg/mL) in soluzione salina tamponata HEPES (20 mM HEPES buffer di soluzione fisiologica salina equilibrata (HBSS) di Hank, regolata per cadere all'interno di un pH di 8-9) in un flaconcino ambrato per minimizzare l'esposizione alla luce ambientale. Mantenere la soluzione mescolando continuamente.
Nota: La formazione di ponti disolfuro tra i tioli coniugati a HA può verificarsi se il pH è superiore a 8, concentrazione della soluzione è troppo alta o la soluzione è lasciata mescolando per troppo a lungo prima di gelificazione. Per evitare questo problema, utilizzare inferiore a 15 mg/mL di tiolate HA e sciogliere chitosani HA entro 2 ore di formazione di idrogel. - Sciogliere 4-braccio-PEG-maleimide (PEG-Mal, 20 kDa) e 4-braccio-PEG-tiolo (PEG-tiolo, 20 kDa) in tampone fosfato salino (PBS), pH 7.4, per preparare 50 mg/mL soluzioni «stock» PEG-Mal e PEG-tiolo.
Nota: Ci vuole almeno 1 ora per sciogliere completamente i reagenti PEG. - Nel caso in cui l'aggiunta di peptidi derivati da ECM, sciogliere peptidi contenenti cisteina in PBS per preparare una soluzione di riserva.
Nota: Utilizzare una concentrazione stock di 2-4 mM. - Ammollo in gomma siliconica stampi in etanolo per almeno 20 min per pulirli e poi autoclave per la sterilizzazione.
3. idrogel reticolazione e incapsulamento cella
Nota: ad esempio, l'incapsulamento di quattro individui, 80 µ l idrogel con 0,5% (p/v) HA e modulo di compressione di 1 kPa Ecco descritto3. Consultare la tabella 1 per le ricette di esempio che producono gli idrogel con proprietà diverse: due idrogeli incorporando il peptide di integrina-associazione RGD e due idrogel che incorpora tappi di cisteina come controllo negativo per attività del peptide. Concentrazione di cellule GBM derivanti dal paziente il seeding è 500.000 cellule/mL.
- Diluire PEG-Mal soluzione madre (50 mg/mL, da passo 2.2) a 12,5 mg/mL aggiungendo 40 µ l della soluzione madre a 120 µ l di PBS. Dividere la soluzione diluita in due provette per microcentrifuga da 1,5 mL, in modo che ogni tubo ha 80 µ l.
- Aggiungere 16 µ l di stock soluzione RGD (2,8 mM, dal passaggio 2.3) in una provetta e 16 µ l di soluzione stock cisteina (2,8 mM, dal passaggio 2.3) per il secondo tubo. Vortice di mescolare. Mettere le soluzioni di PEG-Mal-RGD o PEG-Mal-CYS sul ghiaccio fino all'utilizzo al punto 3.9.
Nota: La procedura come descritto qui rese idrogel con ~ 140 µM del peptide. Ciò equivale a circa 1 su ogni 8 braccia PEG disponibile essere occupato con un peptide. Questo può essere variato modificando il rapporto molare di peptidi cisteina-terminato ai gruppi di maleimide disponibili. In generale, una concentrazione massima di 280 µM del peptide può essere raggiunto pur lasciando un numero sufficiente di maleimide gruppi disponibili per reticolazione di idrogel. - Diluire la soluzione stock PEG-tiolo (50 mg/mL, da passo 2.2) a 5 mg/mL di miscelazione 4 µ l di 50 mg/mL soluzione di riserva con 36 µ l di PBS. Aggiungere 120 µ l di chitosani disciolto, HA dal passaggio 2.1 alla miscela.
Nota: Soluzioni di HMW HA sono molto viscosi. Così, si consiglia di utilizzare la punta della micropipetta wide-orifizio al trasferimento di soluzioni. Pipettare lentamente per evitare soluzione attaccare alle pareti della punta della micropipetta e per migliorare l'accuratezza di misura. - Posizionare gli stampi puliti e asciutti (preparati al punto 2.4) in ciascun pozzetto di una piastra 12-pozzetti trattata di non-tessuto cultura. Utilizzando l'estremità smussata, pulito di punta di una pipetta, premere il gel di muffa e doppio controllo tenuta tra stampi e inferiore della piastra di ben.
Nota: Controllare la tenuta del nuovo destra prima di incapsulamento per evitare perdite. - Passaggio di cellule GBM coltivate, dissociare a cellule singole e determinare concentrazione cellulare come precedentemente descritto3.
Nota: Alcune linee GBM non possono essere dissociate di singole cellule. In questo caso, può essere incapsulato tutta gliomaspheres. Tuttavia, preparare singole cellule dissociate dopo conta cellulare precisi per migliorare la riproducibilità. Il protocollo per gliomasphere passaggio varia tra laboratori diversi e molti di questi sono probabilmente compatibile con incapsulamento di idrogel.- (Consigliato) Centrifuga gliomaspheres a 500 x g per 5 min, rimuovere il supernatante e aggiungere 1 mL di enzima di dissociazione della cellula per il pellet cellulare. Quindi, incubare per 5 min, picchiettando delicatamente il tubo ad agitare.
- Aggiungere 4 mL di terreno di coltura completa (EGF, FGF-2, 25 µ g/mL eparina, G21 supplemento e 1% di penicillina/streptomicina di 20 ng/mL in DMEM/F12 50 ng/mL) per le cellule.
- Centrifugare nuovamente a 500 x g per 5 min e rimuovere il surnatante. Infine, risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno completo e passare le cellule sospese attraverso un colino di cella di 70 µm. (Consigliato) lavare il filtro con un ulteriori 4 mL di terreno completo per massimizzare il numero di celle recuperato.
- Stimare la concentrazione di cellule in sospensione utilizzando un emocitometro. Dividere la sospensione cellulare in 2 provette da centrifuga, dove ogni tubo contiene cellule ~ 80.000. Centrifugare a 500 g per 5 min; in genere, 80.000 cellule compongono 2 80 µ l idrogeli.
- Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet di uno a 80 µ l di soluzione di PEG-MAL-RGD e un secondo pellet in 80 µ l di soluzione di PEG-MAL-CYS (preparata al punto 3.1).
- Usando un 200 µ l, punta larga-orifizio micropipetta, dispensare 40 µ l di soluzione HA (dal passaggio 3.3 sopra) in ogni stampo in silicone di gomma (come preparato al punto 3.4).
- Utilizzando un 200 µ l, punta larga-orifizio micropipetta, mescolare il 40 µ l di PEG-MAL-CYS o PEG-MAL-RGD cella soluzione con la soluzione HA nello stampo. Pipettare su e giù rapidamente non più di 10 volte. Ripetere per ogni cultura di gel in fase di preparazione.
Nota: Questo passaggio richiede pratica, poiché la gelificazione iniziale si verifica rapidamente (entro 30 s). Pipettare su e giù mentre si muove la punta in diverse posizioni in stampi per garantire anche miscelazione. Tenere sempre la punta sotto il livello del liquido per evitare la formazione di bolle d'aria. Fare non mescolare la soluzione troppe volte come gel può ottenere formata all'interno la micropipetta suggerimento. PEG-MAL-CYS e PEG-MAL-RGD possono essere combinati a vari rapporti per ottenere la desiderata concentrazione di peptide RGD. - Posizionare la piastra di pozzetti contenenti cellule gel-incapsulati in un'incubatrice di coltura cellulare di 37 ° C per 5-10 minuti per il completamento della reazione.
- Aggiungere 2-2.5 mL di terreno di coltura ad ogni pozzetto con formato gel. Utilizzare una sterile, punta della pipetta 2 µ l o micro-spatola, per separare delicatamente la muffa e gel. Utilizzare pinze pre-sterilizzate per togliere la muffa dalla piastra ben. Posizionare la piastra ben torna a incubatrice cellulare (37 ° C e 5% CO2) per la cultura e gli esperimenti futuri.
Nota: Tirare lo stampo verticalmente verso l'alto per evitare di danneggiare le colture di gel. In generale, media in gel culture deve essere sostituito ogni 3-4 giorni. Fare attenzione a non per aspirare idrogel quando si toglie di mezzo. Se si tratta di un problema, si consiglia di utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica. Se è prevista la bioluminescenza imaging per monitorare il numero di cellule, cellule di GBM devono essere trasdotte con lentivirus codifica costitutivamente espressione di luciferase prima di incapsulamento, come descritto in precedenza3. Per l'imaging di bioluminescenza, aggiungere 1 mM di D-luciferina al terreno di coltura 1 h prima dell'imaging luminescenza.
4. lisato preparazione per macchiarsi occidentale
- Chill per microcentrifuga da 1,5 mL su ghiaccio (1 a campioni di gel). Centrifuga raffreddare a 4 ° C.
- Rimuovere il mezzo di da piastre a pozzetti. Trasferire gel in microcentrifuga prechilled.
- Aggiungere 100 µ l di tampone RIPA con gli inibitori di proteasi/fosfatasi x 1.
- Usando una siringa da 1 mL con un ago di 20 G, rompere il gel spingendo la miscela intera attraverso ago almeno 20 volte.
- Flash spin l'esempio utilizzando la panca superiore microcentrifuga e posto il campione di nuovo sul ghiaccio.
- Vortice campioni brevemente ogni 5 minuti per un totale di 20 min.
- Centrifugare i campioni a 14000 x g per 15 min a 4 ° C.
- Trasferire il surnatante in nuove, pre-refrigerati per microcentrifuga e conservare a-20 ° C (a breve termine) o e -80 ° C (a lungo termine). Eseguire l'elettroforesi del gel utilizzando le procedure standard, come descritto in precedenza3.
5. estrazione di singole cellule da culture di idrogel per citometria a flusso
- Rimuovere cultura di gel medium e trasferimento (dal punto 3.11) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
- Incubare il gel con 500 µ l di enzima dissociazione della cellula (ad es., TrypLE Express) a 37 ° C per 5 min, occasionalmente sfogliando il tubo ad agitare.
- Trasferire il composto in una provetta da centrifuga 50ml con 5 mL di terreno completo. Posizionare il tubo sul ghiaccio.
- Inserire un ago di 20G su una siringa da 10 mL. Tirare delicatamente la sospensione cellulare su e giù attraverso l'ago 8 volte.
- Fluire la miscela attraverso 70 µm colino di cella in una nuova provetta da centrifuga 50 mL. Applicare un ulteriore 5 mL di terreno completo attraverso il colino per raccogliere tutte le cellule rimanenti.
- Centrifugare il campione a 400 x g per 5 min. eliminare il surnatante e risospendere il pellet in buffer desiderato per citometria a flusso (utilizzando protocolli standard3).
6. Crioconservazione degli idrogeli per il sezionamento
- Rimuovere il mezzo di da culture di gel (dal punto 3.11).
- Incubare le colture di gel con 2 mL di paraformaldeide al 4% (PFA) a 4 ° C durante la notte.
Attenzione: PFA è tossico e deve essere maneggiato con cura. - Il giorno successivo, rimuovere PFA. Aggiungere 2 mL di saccarosio al 5% in PBS per gel e incubare per 1 h a temperatura ambiente.
- Sostituire il 5% di soluzione di saccarosio con 2 mL di saccarosio al 20% in PBS e incubare per 30 min.
- Sostituire la soluzione di saccarosio con 2 mL di saccarosio al 20% fresco in PBS e incubare per altri 30 min.
- Per la terza volta, sostituire la soluzione di saccarosio con 2 mL di saccarosio al 20% fresco in PBS. Incubare per una notte a 4 ° C.
- Preparare il 20% di saccarosio in composto di temperatura ottimale di taglio (OCT).
Nota: A causa della viscosità di OCT, dissoluzione del saccarosio può richiedere alcuni tempo (fino a pernottamento). Si consiglia di mettere la miscela su un agitatore durante la dissoluzione di mantenere agitazione. - Il giorno successivo, rimuovere la soluzione di saccarosio 20% e delicatamente versare il 20% di saccarosio in soluzione OCT sopra il gel. Assicurarsi di coprire il gel intero. Incubare a 4 ° C per 3 h.
- Trasferire il gel al centro di un incorporamento stampo usando una spatola grande, piatta; Questo deve essere fatto con attenzione per evitare di danneggiare il gel.
- 2-metilbutano cool all'interno di una criocamera con un eccesso di ghiaccio secco.
- Riempire lo stampo incorporamento con OCT puro (senza saccarosio). Riempire a appena sotto il bordo superiore dello stampo.
- Congelare il campione di idrogel per immersione in raffreddato 2-metilbutano e quindi procedere al sezionamento.
- Sezione il campione utilizzando un criostato; spessore di taglio di 10-18 µm e sezionamento temperatura intorno ai-26 ° c sono raccomandati.
- Eseguire procedure standard immunostaining sulla cultura gel sezionato, come descritto in precedenza3.
Nota: PFA è noto irritante e cancerogeno. Maneggiare e smaltire PFA secondo le direttive e gli standard vigenti a livello locale.
7. estrazione di RNA totale da campioni in idrogel
Nota: Qui, descriviamo un protocollo utilizzando uno spot kit (vedere la tabella materiali) per estrarre RNA totale dalle cellule coltivate di idrogel. I buffer e tutto il materiale sono disponibili all'interno del kit utilizzato.
- Rimuovere il terreno di coltura. Utilizzare una pipetta di trasferimento P1000 con wide-bore punta a diffondere la cultura di idrogel in provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
- Aggiungere 350 µ l di tampone RLT alla cultura di idrogel.
- Utilizzando un ago 20 G attaccato ad una siringa da 1 mL, tagliuzzare il gel spingendo la miscela intera attraverso ago almeno 20 volte.
- Trasferire la miscela intera in una colonna di omogeneizzatore collocata in una provetta da 2 mL. Centrifugare a 13.000 x g per 2 min.
- Trasferire il surnatante in una provetta da microcentrifuga pulito 1,5 mL. Fare attenzione a non disturbare il precipitato di gel nella parte inferiore.
- Mescolare il campione lisato con 350 µ l di etanolo al 100%. Trasferire il campione di tutti in un posto di colonna (dal kit) di spin in un tubo di raccolta da 2 mL. Centrifugare per 1 min a 13.000 x g.
- Per i passaggi successivi per la purificazione di RNA per PCR, seguire il protocollo generale fornito dal produttore del kit.
Nota: Una volta estratto RNA, protocolli standard per la PCR possono essere utilizzati.
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Representative Results
Per ogni lotto di tiolate HA, il grado di thiolation dovrebbe essere verificato utilizzando1H -NMR o prova di un Ellman. HA modifica utilizzando la procedura descritta qui costantemente genera thiolation ~ 5% (definito come il rapporto molare dei tioli a HA disaccaridi) (Figura 1).
Configurazione di questa nuova piattaforma di cultura richiederà ogni laboratorio per eseguire test rigorosi per garantire redditività buona cultura prima dell'implementazione di esperimenti su larga scala. Nostro 80 idrogeli µ l con una semina densità 500.000 cellule/mL (40.000 cellule/gel) risultato costantemente nei tassi di proliferazione che sono paragonabili per, o meglio, gliomasphere culture (Figura 2A-2 C). Come HA/PEG idrogeli sono otticamente trasparenti, i comportamenti delle cellule possono essere osservati direttamente in culture live, 3D usando microscopia di contrasto o fluorescenza di fase. Figura 3A dimostra che, 4 giorni dopo l'incapsulamento, cellule di GBM in idrogel contenenti RGD presentano un fenotipo invasivo, mentre le cellule coltivate in idrogel utilizzando PEG-MAL-CYS controlli hanno una morfologia sferica.
Come è tipico con modelli di xenotrapianto dove i ricercatori devono aspettare giorni per mesi fino a raggiungono tumori impiantati crescita progressiva24,32, cellule derivate dal paziente anche prendono tempo per adattarsi ad un nuovo contesto di cultura. Così, si consiglia di coltura 4-8 giorni prima di iniziare gli esperimenti, come il trattamento farmacologico, per garantire la maggior parte delle cellule sono entrate nella fase di crescita esponenziale. Di là di trattamenti farmacologici, reagenti come solubile cyclo-RGD, che competitivi perturbare interazioni cellula con RGD in idrogel, possono essere aggiunti al terreno di coltura (Figura 3A).
Il nostro sistema di idrogel è compatibile con molti metodi comuni per lo studio di biologia delle cellule di glioma. Usando la formazione immagine di bioluminescenza, che viene comunemente utilizzata per monitorare i tumori xenotrapiantati roditore, numeri relativi delle cellule vitali possono essere osservati in idrogel culture durante il corso del trattamento. Figura 3B fornisce un esempio di questo metodo, dove gli effetti del trattamento di erlotinib sulle cellule GBM idrogel-coltivati sono stati valutati in 6 giorni. In generale, idrogel culture possono essere trattate come campioni di tessuto durante la preparazione lisati per Western blot o PCR. Analisi Western blot della polimerasi ADP poli spaccati indica che il relativo grado di apoptosi in cellule di atterramento CD44 trattate è superiore a cellule di GBM wildtype coltivate in 0,5% idrogel HA (Figura 3). Allo stesso modo, sospensioni di cellule singole possono essere preparate da culture di idrogel per l'analisi tramite citofluorimetria usando protocolli standard per la liberazione di singole cellule da tessuti intatti (Figura 2). Oltre alle caratteristiche delle cellule, cryosections delle culture basate su idrogel, 3D preservare ECM depositati dalle cellule coltivate. Ad esempio, modelli di deposizione dello spostamento del collagene di tipo IV previo trattamento di erlotinib di idrogel culture (Figura 3D).
Figura 1 : Rappresentante H 1 -RMN spettro dell'acido ialuronico chitosani. Picchi integrati indicano che circa il 5% dei gruppi di acido glucuronico ettari sono stati modificati con un tiolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Proliferazione delle cellule di idrogel-incapsulato. A) immagini di esempio di fabbricato 80 gel µ l in 12 pozzetti. Dopo reticolazione, idrogeli sono stati gonfiati in mezzo di coltura cellulare. B) risultati rappresentativi del tasso di proliferazione misurata mediante citometria a flusso. Cellule di GBM (HK301) sono state incubate con 1 µM EdU (5-Etinil-2 '-deoxyuridine) per 2,5 h il quarto giorno dopo l'incapsulamento e il passaggio. Una clic-reazione è stata usata a coniugare la tintura fluorescente per EdU incorporato, come dettagliato nella Xiao et al. 2017.3 controlli negativi, cui nessun EdU è stato aggiunto alle culture, sono stati inclusi. Immagini di microscopia confocale C) rappresentante di vivono (verde) e morti (rosso) cellule 24 ore dopo idrogel culture di cellule di GBM (HK157) sono state stabilite. Scala bar = 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Caratterizzazione. A) immagini di contrasto di fase rappresentante di 0,5% (p/v) HA cellule di idrogel-coltivati sotto diverse condizioni per 8 giorni dopo l'incapsulamento. Le frecce indicano le cellule con una morfologia dilagante. B) immagini rappresentative del segnale di bioluminescenza misurata dopo i 15 giorni del trattamento con 1 µM erlotinib o veicolo (DMSO). 1 mM D-luciferina è stato aggiunto al terreno di coltura cellulare 1 h prima di formazione immagine. Le cellule sono state trasdotte con lentivirus codifica per espressione costitutiva di luciferasi firefly prima dell'incapsulamento. C) rappresentante immunitario-macchia immagini analizzando spaccati Poli ADP polimerasi (cl-PARP) espressione in cellule di GBM (HK301) coltivata in idrogel con 0,5% (p/v) HA e 1 modulo di compressione kPa. Tutto ritagliata immagini mostrate erano dalla macchia stessa. D) rappresentante la macchiatura del collagene IV (verde) e Hoechst 33342 (blu) in idrogel in coltura di cellule di HK301 12 giorni dopo il trattamento con 1 µm erlotinib o veicolo (DMSO). Barra della scala = 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Tipo gel | Parte un (40 µ l ciascuna) | Parte B (da 40 µ l) | ||||
| 4Arm-PEG-MAL (50mg/mL) | Cisteina o RGD (2,81 mM) | PBS (pH 7,4) | 4Arm-PEG-tiolo (50mg/mL) | PBS (pH 7,4) | HA-S (13,3 mg/mL) | |
| 0,5% (p/v) HA 1kPa | 10 Μ l | Μ l 4.00 | 26 Μ l | Μ l 1.00 | 9,00 Μ l | 30.0 Μ l |
| 0,5% (p/v) HA 2kPa | 20,0 Μ l | Μ l 4.00 | 16.0 Μ l | Μ l 8,00 | Μ l 2.00 | 30.0 Μ l |
| 0,1% (p/v) HA 1kPa | 10 Μ l | Μ l 4.00 | 26 Μ l | Μ l 8,00 | Μ l 26.0 | 6.00 Μ l |
Tabella 1. Formulazioni di idrogel restituendo il controllo indipendente della concentrazione dell'HA e proprietà meccaniche.
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Discussion
Generazione di dati riproducibili utilizzando questo sistema di coltura 3D richiede: 1) coerente-lotto thiolation di HA, 2) pratica per raggiungere efficiente miscelazione dei precursori di idrogel e manipolazione di idrogel culture per evitare danni e 3) ottimizzato semina densità per ogni linea cellulare utilizzato.
Quando una percentuale di peso particolare di HA desiderata nell'idrogel, il grado di thiolation di HA determina la densità di reticolazione. Si consiglia di utilizzare una quantità costante di HA per ogni reazione thiolation per minimizzare le variazioni da lotto a lotto. Suggeriamo che almeno 300 mg di HA essere utilizzato per ogni reazione thiolation affinché la stessa serie di chitosani HA può essere utilizzata per più ripetizioni sperimentale. Il rapporto molare dei tioli di maleimide gruppi su PEG 4-braccio dovrebbe essere sempre essere 1.1:1 per garantire un'efficienza massima reticolazione. Così, se il grado di thiolation è vario, quindi la quantità di PEG-Mal aggiunto deve essere regolata di conseguenza. Quando peptidi sono coniugati per le maleimidi prima della formazione di gel, il numero stimato di braccia di PEG con peptidi tethered deve essere sottratto il numero totale delle maleimidi disponibili per questo calcolo. Inoltre, si consiglia di mantenere il grado di thiolation HA inferiore a 10-15% per evitare la formazione di legami disolfuro che impedirà la dissoluzione e gelificazione coerente.
La reazione di addizione di Michael-tipo tra i gruppi tiolo e maleimide assicura che gelificazione si verifica meno di un minuto. Mentre questo gelificazione veloce riduce al minimo la quantità di tempo sospese in idrogel precursori di cellule sono senza mezzo completo, che può compromettere la loro sopravvivenza, il processo di incapsulamento richiede l'esperienza con tutti il pipettaggio e miscelazione passi per raggiungere risultati riproducibili. In genere, abbiamo nuovi tirocinanti pratica diversi turni di gelificazione senza cellule prima di eseguire esperimenti di incapsulamento "reale".
Due fattori possono essere modificati per modulare la velocità di gelificazione: reazione pH temperatura e precursore. Abbassamento della temperatura di reazione inserendo la piastra ben sul ghiaccio, mescolando rallenta la reazione e fornisce per maggiore tempo mescolare soluzioni precursore. Tuttavia, questo deve avvenire in condizioni di sterilità usando tecniche asettiche appropriate. Allo stesso modo, il pH delle soluzioni di precursore può essere modificato per aumentare o diminuire il tempo di reazione utilizzando il pH è superiore o inferiore, rispettivamente. Poiché chitosani HA sono dializzato contro acqua acida per prevenire la formazione di legami disolfuro, ricostituito chitosani HA resa di pH inferiore in caso contrario potrebbe essere previsto. In generale, la ricostituzione in 20 mM HEPES buffer di HBSS, regolata a pH 9, produrrà un pH vicino a 7 quando 15 mg/mL di tiolate HA (~ 5% chitosani) sono dissolto. Si consiglia di utilizzare pH 6,8-7 chitosani soluzione HA per consentire anche miscelazione della soluzione di gel e massimizzando la salute delle cellule.
Densità di semina durante l'incapsulamento è fondamentale per la vitalità cellulare e riproducibilità sperimentale. Si consiglia di semina nell'intervallo di 100.000 a 2.000.000 cellule/mL. Abbiamo trovato che questo intervallo è ottimo per la vitalità della maggior parte dei tipi di cellule, evitando over-confluency entro un periodo sperimentale di almeno 3 settimane. La densità di semina iniziale che ottimizza la redditività dovrebbe essere determinata sperimentalmente per ogni tipo di cellulare utilizzato.
Estrema cura occorre prestare cambiando medium delle cellule in modo da evitare dannosi idrogel culture. In particolare, fare attenzione a non per aspirare idrogel nella pipetta. Così, non utilizzare l'aspirazione a vuoto e invece utilizzare una pipetta sterile per aspirare manualmente. Cambiare solo la metà il mezzo in una cultura bene in un momento può anche aiutare.
In generale, questa tecnica richiede pratica per ottenere la necessaria destrezza manuale e la coerenza. Una volta stabilito un protocollo di specifiche di laboratorio, il sistema 3D cultura permette al ricercatore di utilizzare molti metodi di caratterizzazione come tipico per colture cellulari e tessuti espiantati. Qui, abbiamo descritto diverse tecniche per l'analisi, tra cui l'immunofluorescenza, citometria a flusso, macchiare occidentale e bioluminescenza imaging delle culture live, 3D (Figura 2-3). Per i protocolli più dettagliati dei metodi di caratterizzazione, vedere Xiao et al 20173. Infine, come HA/PEG idrogeli sono otticamente trasparenti, tecniche di microscopia luce standard, compreso formazione immagine confocal, possono essere usati per monitorare culture live, 3D.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato con finanziamenti dal NIH (R21NS093199) e premio della UCLA ARC 3R. I nostri più sentiti ringraziamenti al laboratorio del Dr. Harley Kornblum per fornitura delle linee cellulari HK301 e HK157. Ringraziamo anche UCLA tessuto patologia Core laboratorio (TPCL) per il criosezionamento, funzione di memoria avanzate luce microscopia/spettroscopia (ALMS) in California Nanosystems Institute (CNSI) presso la UCLA per l'uso del microscopio confocale, UCLA Crump Istituto per Imaging molecolare per l'utilizzo del sistema di imaging IVIS, UCLA molecolare strumentazione Center (MIC) per fornire la spettroscopia a risonanza magnetica e flusso Cytometry Core in Jonsson completa Cancer Center (JCCC) presso la UCLA per la fornitura di strumentazione per il flusso cytometry.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pH meter | Thermo Fisher | N/A | Any pH meter that has pH 2-10 sensitivity |
| Stir plate | Thermo Fisher | N/A | General lab equipment |
| Erlenmeyer flask (125mL) | Thermo Fisher | FB-501-125 | |
| dialysis tubes | Thermo Fisher | 21-152-14 | |
| 2L polypropylene beaker | Thermo Fisher | S01916 | |
| sodium hyaluronan | Lifecore | HA700k-5 | 500-750 kDa range |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Thermo Fisher | PI-22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | sigma aldrich | 130672-5G | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher | SA48-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher | SS266-1 | |
| Cystamine dihydrochloride | Thermo Fisher | AC111770250 | |
| Dithiolthreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172-25 | |
| Ellman's test reagent (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoic acid | Sigma Aldrich | D218200-1G | |
| Deuterated water (deuterium oxide) | Thermo Fisher | AC166301000 | |
| 0.22µm vacuum driven filter | CellTreat | 229706 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | P32080-100T | |
| Hanks' balanced salt saline (HBSS) | Thermo Fisher | MT-21-022-CV | |
| 4-arm-PEG-maleimide | JenKem Technology | A7029-1 | molecular weight around 20kDa |
| 4-arm-PEG-thiol | JenKem Technology | A7039-1 | molecular weight around 20kDa |
| L-Cysteine | sigma aldrich | C7880-100G | |
| RGD ECM mimetic peptide | Genscript Biotech | N/A | Custom peptide with sequence "GCGYGRGDSPG", N-terminal should be acetylated |
| silicone molds | Sigma Aldrich | GBL664201-25EA | Use razor blade to cut into single pieces |
| complete culture medium | Various | Various | DMEM/F12 (Thermofisher) with non-serum supplement (G21 from GeminiBio), epidermal growth factor 50ng/mL (Peprotech), fibroblast growth factor 20ng/mL (Pepro Tech) and heprain 25µg/mL (Sigma Aldrich), culture medium varies in different labs |
| patient derived GBM cell | N/A | N/A | |
| 20G needle | BD medical | 305175 | |
| 1mL syringe | Thermo Fisher | 14-823-434 | |
| 10mL syringe | BD medical | 302995 | |
| RIPA Buffer | Thermo Fisher | PI-89901 | |
| protease/phosphatase inhibitor mini tablet | sigma aldrich | 5892970001 | |
| vortex shaker | Thermo Fisher | 12-814-5Q | |
| TrypLE express | Thermo Fisher | 12604013 | |
| 70µm cell strainer | Thermo Fisher | 22-363-548 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher | AC416785000 | Dissolve 4% (w/v) in PBS, keep pH 7.4 |
| D-sucrose | Thermo Fisher | BP220-1 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Thermo Fisher | NC9373881 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | N/A | Any General One with 5% CO2 and 37C |
| fridge/freezer | Thermo Fisher | N/A | Any General Lab equipment with -20C and -80C capacity |
| Disposable embedding molds | Thermo Fisher | 12-20 | |
| Lyapholizer | Labconco | N/A | Any -105C freeze dryers |
| HEPES | Thermo Fisher | BP310-500 | |
| Amber vial | Kimble Chase | 60912D-2 | |
| Wide orifice pipette tips | Thermo Fisher | 9405120 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | 03551-4 | |
| Dry Ice | N/A | N/A |
References
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