Summary

Quantifizierung der Hypopigmentation Aktivität In Vitro

Published: March 06, 2019
doi:

Summary

Wir beschreiben drei experimentelle Methoden zur Bewertung der Hypopigmentation Aktivität von Chemikalien, die in-vitro-: Quantifizierung der 1) zellulären Tyrosinase-Aktivität und Melanin (2) Inhalt und (3) Messung von Melanin durch zelluläre Melanin Färbung und Bildanalyse.

Abstract

Diese Studie stellt Labormethoden für die Quantifizierung von Hypopigmentierung Aktivität in vitro. Melanin, das große Pigment in Melanozyten, wird als Reaktion auf mehrere zelluläre und umweltbedingten Faktoren synthetisiert. Melanin schützt die Hautzellen vor UV-Schäden, aber auch biophysikalische und biochemische Funktionen hat. Übermäßige Produktion oder Ansammlung von Melanin in den Melanozyten kann dazu führen, dass dermatologische Problemen, wie z. B. Muttermale, Sommersprossen, Pigmentflecken und Melasma. Daher ist die Kontrolle der Melanogenese mit Hypopigmentierung Agenten wichtig bei Patienten mit klinischen oder kosmetische Bedürfnisse. Melanin wird in erster Linie in den Melanosomen Melanozyten in einen komplexen biochemischen Prozess namens Melanogenese, welche von der Erwartungshaltung extrinsischen und intrinsischen Faktoren wie Hormone, Entzündungen, Alter und UV-Licht Exposition synthetisiert. Wir beschreiben drei Methoden zur Bestimmung der Hypopigmentation Aktivität von chemischen oder natürlichen Substanzen in Melanozyten: Messung von (1) zellulären Tyrosinase-Aktivität und Melanin (2) Inhalt und (3) Färbung und Quantifizierung zellulären Melanin mit Bild Analyse.

In Melanogenese katalysiert Tyrosinase die Bandbreitenbegrenzung Schritt, der L-Tyrosin in 3,4-Dihydroxyphenylalanine (l-Dopa) und dann in Dopaquinone umwandelt. Daher ist die Hemmung der Tyrosinase eine primäre Hypopigmentierung Mechanismus. In kultivierten Melanozyten kann Tyrosinase-Aktivität durch Hinzufügen von l-Dopa als Substrat und Messung Dopaquinone Produktion durch Spektralphotometrie quantifiziert werden. Melanogenese kann auch durch Quantifizierung des Melanin Inhalts gemessen werden. Der Melanin-haltigen zelluläre Anteil wird mit NaOH extrahiert und Melanin wird spektrophotometrisch quantifiziert. Zu guter Letzt kann der Melanin Inhalt durch die Bildanalyse nach Fontana-Masson Färbung von Melanin quantifiziert werden. Obwohl die Ergebnisse dieser in-vitro-Untersuchungen nicht immer in der menschlichen Haut reproduziert werden können, sind diese Methoden vor allem als erster Schritt um potenzielle Hypopigmentierung Aktivitäten zu erkennen in der Melanogenese Forschung, verbreitet. Diese Methoden können auch zur Aktivität der Melanozyten, Wachstum und Differenzierung zu bewerten. Die Gültigkeit der Effekte gewährleisten konsistente Ergebnisse mit drei verschiedenen Methoden.

Introduction

Melanin spielt eine entscheidende Rolle in der Physiologie, Pathologie und Toxikologie mehrere Organe einschließlich der Haut, Augen und Gehirn1. Hauptfunktionen von Melanin sind Foto-Screening und biochemischen Wirkungen. Melanin absorbiert Nah-Infrarot- und sichtbares Licht sowie Ultraviolett (UV) Strahlung, mit erhöhten Absorptionsraten bei kürzeren Wellenlängen des Lichts; Melanin schützt somit vor Schäden durch sichtbares Licht oder UV Strahlung2Gewebe. Melanin ist ein Antioxidans und hat eine Affinität für Metalle und andere giftigen Chemikalien; Daher kann es Gewebe vor oxidativen und chemischen Stress3schützen. Allerdings verursacht die übermäßige Produktion von Melanin dermatologische Probleme.

Die Quantität und Qualität von Melanin in der Haut und Iris sind die wichtigsten Determinanten der Farbe der Iris und der Haut. Menschen können unterschiedlicher Hautfarbe Farbvorlieben haben; Einige bevorzugen gebräunten Haut, während andere hellere Hautfarben bevorzugen. Abhängig von diesen Verbraucherprofile entwickelten Hypopigmentierung Kosmetik Einzelmärkte für bevorzugte Haut Farben4zu befriedigen. Dementsprechend sind Studien der Hypopigmentation und Anti-Melanogenic Tätigkeit wichtig, sowohl wissenschaftlich als auch praktisch.

Melanogenese ist der komplexe Prozess der Melanin Biosynthese durch eine Reihe von enzymatischen und spontane chemische Reaktionen in Melanozyten. Eine Melanozyten ist umgeben von ca. 36 Keratinozyten und Melanozyten sind die Melanin-Synthese-Fabriken, die ihr Produkt zu benachbarten Keratinozyten verteilen. In der Haut wird das Melanin produziert und gespeichert in der Melanosomal Fach der Melanozyten zu benachbarten Keratinozyten in die Epidermis über Dendriten transportiert.

L-Tyrosin dient als das ursprüngliche Substrat für Melanogenese und das Enzym Tyrosinase zwei aufeinander folgende Reaktionen katalysiert, die L-Tyrosin in 3,4-Dihydroxyphenylalanine (DOPA) und dann in Dopaquinone umwandeln. Diese Reaktionen sind die Bandbreitenbegrenzung Schritt Melanogenese5,6. Dementsprechend kann Hypopigmentierung Aktivität zuerst durch Beurteilung zellulärer Tyrosinase-Aktivität direkt gemessen werden. Hierzu sind Melanozyten Extrakte mit Tyrosinase mit DOPA inkubiert und die Dopaquinone produziert in den Proben gemessen werden, durch Spektralphotometrie auf 475 nm. Die Werte werden durch die Proteinkonzentrationen der Proben und Stoffe mit Hypopigmentierung Aktivität führen zu weniger Dopaquinone Bildung im Vergleich zu Kontrollen normalisiert.

Zweitens kann Hypopigmentierung Aktivität durch Messung von Melanin in kultivierten Melanozyten direkt quantifiziert werden. Nach der Behandlung der Zellen mit dem Testmaterial, Melanin unter alkalischen Bedingungen gewonnen wird und der Melanin Inhalt wird quantifiziert durch Spektralphotometrie bei 400 nm. Ein Hypopigmentierung Agent führt zu einem niedrigeren Gehalt an Melanin als die Kontrollen-7.

Schließlich kann die Hypopigmentation Aktivität mit Fontana-Masson Melanin Färbung und anschließende Bildanalyse quantifiziert werden. In der Fontana-Masson Färbung, Melanin Granulat Ammoniak-Silbernitrat auf einen sichtbaren schwarzen metallischen Zustand reduzieren und die schwarzen Bereiche von Zellen in mikroskopische Aufnahmen repräsentieren die Menge an Melanin.

Ein Hypopigmentierung Agent gibt in der Regel einheitliche und vergleichbare Ergebnisse mit diesen drei Methoden, die bestätigt, dass die Aktivität des Stoffes gültig ist. Alternativ kann es nützlich, um den Ausdruck von wichtigen Genen und Proteinen in Melanogenese in Beantwortung einer Prüfsubstanz Hypopigmentierung Aktivität untersuchen zu messen sein. Wichtige Enzyme in Melanogenese8sind neben Tyrosinase Tyrosinase-related Proteine (TRP-1) und Dopachrome Tautomerase (TRP-2). Die Transkription Faktor Mikrophthalmie-assoziierter Transkriptionsfaktor (MITF) ist ein master Regulator Melanogenese und Quantifizierung von seiner gen/Proteingehalte Ausdruck oder ein Promotor-Aktivität-Assay kann auch zur Hypopigmentierung Tätigkeit zu beurteilen.

Protocol

1. Vorbereitung von Mediums, Verbindungen und Reagenzien B16F10 komplette Wachstumsmedium vorzubereiten. Ergänzung Dulbecco geändert Adlers Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin (PEST). Um 500 mL des kompletten Medium zu machen, mischen Sie 445 mL Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) mit 50 mL der FBS und 5 mL von PEST in eine sterilisierte Glasflasche 1 L. Nach dem Mischen sanft, Filtern Sie das Medium durch einen 0,2 µm Flaschenverschluss Filter, u…

Representative Results

Repräsentative Ergebnisse für die Hypopigmentation Aktivität von Arbutin, ein Anti-Melanogenic compound in B16F10 Melanozyten sind unten dargestellt. Abbildung 1A zeigt, dass Arbutin deutlich unterdrückt die zelluläre Tyrosinase-Aktivität im Vergleich mit dem Fahrzeug behandelt. In ähnlicher Weise wurde der Melanin Inhalt von Zellen stimuliert mit Arbutin deutlich im Vergleich mit den Reglern (Abbildung 1 b) reduziert. Mik…

Discussion

Wir präsentierten Protokolle für die Bewertung der Hypopigmentation Aktivität der Testverbindungen mit kultivierten Melanozyten. Die repräsentativen Ergebnisse zeigten die Hypopigmentation Wirkung von Arbutin, ein Tyrosinase-Inhibitoren, die Tyrosinase-Aktivität und zellulären Melanin Inhalt gehemmt. Diese Methoden sind in der Anti-Melanogenic Aktivität Forschung verbreitet. Mit diesen Tests, haben wir auch erfolgreich identifiziert mehrere bioaktive Substanzen, die Melanogenese hemmende Effekte auf B16F10 Zellen …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde vom Korea Institute of Planning und Bewertung für Technologie in der Ernährung, Landwirtschaft und Forstwirtschaft (IPET) durch das Agri-Bioindustrie Technology Development Program, finanziert von der Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs (MAFRA unterstützt. ) (116159-02-2-WT011) und Hochschule für Life Sciences und Biotechnologie für BK21 PLUS, Korea University.

Materials

3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine Sigma D9628
Ammonium hydroxide solution Sigma #320145
Arbutin Fluka #10960
DMEM HyClone SH30243.01
FBS HyClone SH30084.03
Formalin Yakuri Pure Chemicals #16223 37%
Gold chloride American MasterTech AHG0226 0.10%
HCl Samchun chemical H0255
KCl Bio basic Canada Inc. PB0440
KH2PO4 Sigma #60218
Na2HPO4 J.T.Baker #3817-01
NaCl Duksan pure chemicals #81
NaOH Sigma 655104
Nuclear fast red Merck 100121 Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate.
Penicillin and streptomycin solution HyClone SV30010
Silver nitrate Duksan Pure Chemicals #900
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) J.T. Baker #3817-01
Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4) Sigma S5011
Sodium thiosulfate pentahydrate Duksan Pure Chemicals #2163
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Bio Basic Canada TB0196
Triton X-100 Union Carbide T8787
Tyrosinase from mushroom Sigma T3824 25 KU

References

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Cite This Article
Kim, Y., Kim, M., Kweon, D., Lim, S., Lee, S. Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro. J. Vis. Exp. (145), e58185, doi:10.3791/58185 (2019).

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