Описывается модель долгосрочного культуры клеток гранулезы говядину сыворотки свободных условиях. Эта модель позволяет исследователям для изучения влияния различных факторов и условий как плотности различных покрытий на характеристики эстроген производителей клетки гранулезы говядину.
Клетки гранулезы яичников (GC) являются основным источником эстрадиола синтеза. Индуцированные перенапряжения preovulatory лютеинизирующего гормона (ЛГ), клеток теки и, в частности, слоя клеток гранулезы глубоко изменить их морфологические, физиологические и молекулярные характеристики и сформировать корпус прогестерон производство желтое тело, которое отвечает за ведение беременности. Модели культуры клеток являются важнейшими инструментами для изучения основных регулирующих механизмов, участвующих в folliculo лютеиновой трансформации. Представленные протокол фокусируется на процедуры изоляции и криоконсервацию говядину GC от малых до средних размеров фолликулов (< 6 мм). С помощью этого метода можно получить почти чисто населения GC. Процедура криоконсервация значительно облегчает время управления культуры клеток работать независимо от подачи ткани (яичники) прямой первичной. Этот протокол описывает модель культуры сыворотки свободных клеток, которая имитирует эстрадиол активный статус крупного рогатого скота GC. Важные условия, которые необходимы для успешного стероид активной клеточной культуры, обсуждаются на протяжении всего протокола. Доказано, что увеличение плотности покрытия клеток вызывает конкретный ответ как указано измененный ген выражение профиль и гормон производства. Кроме того эта модель обеспечивает основу для дальнейших исследований на GC дифференциации и других приложений.
Успешный овуляции и luteinization зависят от тонко настроены и хорошо спланированных молекулярные изменения в типах различных соматических фолликулярных клеток. Поскольку детали этих процессов развития пока еще полностью не поняты, дальнейших разъяснений не требуется. В естественных условиях подходы являются сложной и дорогостоящей и, в частности, не адрес конкретные молекулярные механизмы, которые происходят во время фолликулогенез. Таким образом упрощенное в vitro модели Кроме того, необходимо обеспечить проницательность в клеточном и молекулярном детали. Различные исследования описывают культуру всего фолликулов в контексте в пробирке оплодотворение методы1,2,3. Потому что ученые заинтересованы в механизмы дифференцировки, многие исследования сосредоточены на фолликулярную GC. Эти клетки, непосредственно связанные с ооцитов, являются основными источниками эстрогена производства и, таким образом, играть важную роль на протяжении фолликулогенез и luteinization4.
Увековечен клеток линии GC были разработаны из разных видов. Большинство из них, однако, не показывают достаточно стероидных гормонов производства5. Пока только одну ячейку строки говядину, GC был создан6, но эта линия потерял свою стероидогенных деятельность после нескольких проходов7. Таким образом начиная с стероидогенеза и, в частности, производство Эстрадиол является важнейшей особенностью GC функциональность, целесообразно изучить эти аспекты в модели культуры главной ячейки. В предыдущих исследованиях было продемонстрировано, что производство значительные эстрадиола может наблюдаться только под сыворотки свободной культуры условий8,9. Далее, предшественником синтеза Эстрадиол является еще одной предпосылкой, как GC не выразить необходимого фермента, который может конвертировать прогестерона в андростендион10. Кроме того синергетический эффект ФСГ и IGF-1 добавок в vitro показали оптимизированный активность ароматазы, ключевого фермента эстрадиола синтез11. В настоящем Протоколе также описываются другие важные факторы, оказывающие существенное влияние на модели культуры GC. В частности клетка, покрытие плотность имеет огромное воздействие на результаты эксперимента12. Кроме того может быть создана методика криоконсервирования говядину GC, который не вмешиваться GC физиологии в культуре значительно. Эта техника помогает улучшить организацию работы культуры клеток и оптимизации плотности предпочтительным покрытие.
Представлена ячеечная модель культуры предоставляет инструмент для анализа клеток гранулезы дифференциации в пробирке. Несколько исследований показали, что сыворотка бесплатно выращивание предпосылкой для поддержания стероидных деятельность в культивированный говядину GC или GC другие виды8,9. Кроме того покрытие культуры блюдо с компонентов внеклеточного матрикса (например, коллагеновая R)13, значительно улучшились вложение клеток. Еще одной важной особенностью является период длительного культуры. Недавно было продемонстрировано, что долгосрочные культуры необходимо получить достаточно стероидогенных активности и сбалансированных выражение гранулезы ячейки личность маркеры17. Похоже, что GC требуется время, чтобы оправиться от физического стресса во время процедуры изоляции.
Средства массовой информации добавки, ФСГ, IGF-1 и андростендион известны побудить активность ароматазы в культивированный GC. Особенно добавки с андростендион является абсолютно необходимым, как GC нужно прекурсором для синтеза эстрадиола. Это был ранее опубликован11,18 и, таким образом, далее не изучалось в ходе настоящего исследования. Однако адаптация ФСГ, IGF-1 и андростендион концентрации может быть необходимым для других экспериментальных установок.
Криоконсервация метод, описанный здесь может помочь улучшить организацию экспериментов культуры ткани, делая их более независимыми от различной питания с яичников. По данным предыдущих испытаний, криоконсервация не влияет на GC фенотип или стероидов производства в культуре. Кроме того обилие маркер стенограммы в культивируемых клеток не выявило значительные различия, сравнения образцов, приготовленных из свежевыделенных клеток с теми, кто ранее подвергался криоконсервирования16.
Важным параметром для нынешней модели культуры GC является покрытие плотности. Как показали Результаты представитель, увеличение плотности покрытия индуцированной значительные изменения физиологических и молекулярных характеристик. Некоторые гены регулируются определенным образом, напоминающие изменений, вызванных стимуляции LH в естественных условиях4,19. Тот факт, что увеличение плотность ячеек можно доехать дифференциация подобных процессов искусственного говядину GC должна тщательно рассматриваться в этой GC в vitro модели, чтобы избежать противоречивых результатов между реплицирует. Таким образом противоречивые результаты других исследований могут быть отнесены к плотности различных клеток и следует изучить более внимательно.
Культура модели, описанной здесь выявлено не реагировать на LH, как стенограммы рецептора LHCGR являются близко к пределу обнаружения. Таким образом имитирует ЛГ всплеск так ситуацию в естественных условиях удалось побудить дифференциация13. Тем не менее эта модель обеспечивает полезный инструмент для изучения эстрадиол активные GC в первичной культуре, в частности, не функциональные говядину GC линии существуют в настоящее время.
Различные клинические протоколы могут испытываться в нынешней модели культуры GC, которые помогут разгадать механизмы регулирования стероидов производства или GC дифференциации. Кроме того, один факторы, которые вовлечены в процессы развития могут анализироваться отдельно. Таким образом эта культура модель обеспечивает основу для множества различных приложений.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Вероника Шрейтер за ее превосходную техническую помощь и полезные изменения установленных криоконсервирования техника и мобильные модели культуры. Кроме того мы хотели бы поблагодарить Maren Андерс и Swanhild Родевальд за их прекрасную техническую помощь в и последующего анализа.
PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+ | Merck-Millipore | L 182-05 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 µg/ml) | Merck-Millipore | A 2213 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
amphotericin (250 µg/ml) | Merck-Millipore | A 2612 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
3 ml syringe (Omnifix Luer) | Braun | 4616025V | |
18 G needle | Roth | C724.1 | |
fetal calf serum | Merck-Millipore | S 0115 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
cryo-preservation vials (2 ml) | TPP Faust | TPP 89020 | |
CoolCell LX cell freezing container | Corning | 432004 | |
culture dish, 24-well, flat bottom | TPP Faust | TPP 92424 | |
collagen R (0.2 %) | Serva | 47254 | |
α-MEM | Merck-Millipore | F 0915 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
L-Glutamin (200 mM) | Merck-Millipore | K 0282 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
sodium bicarbonate | Merck-Millipore | L 1713 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
BSA | Sigma | A3311 | |
HEPES | Merck-Millipore | L 1603 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
sodium selenite | Sigma | S9133 | dissolved in sterile water |
transferrin | Sigma | T1283 | dissolved in sterile water |
insulin (10 mg/ml) | Sigma | I0516 | dissolved in 1x PBS |
NEA | Merck-Millipore | K 0293 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
FSH | Sigma | F4021 | we prefer to use a stock solution of 2 µg/ml, diluted in 0.9 % NaCl |
LR3-IGF-1 | Sigma | I1146 | we use a stock solution of 2 µg/ml, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/ml BSA |
androstenedione | Sigma | 46033 | we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol |