Se describe un modelo de cultura a largo plazo de las células de la granulosa bovina en condiciones libres de suero. Este modelo permite a los investigadores estudiar los efectos de diversos factores y condiciones como placas diferentes densidades en las características de la producción de estrógeno células de la granulosa bovina.
Las células granulosas del ovario (GC) son la mayor fuente de síntesis de estradiol. Inducida por el aumento preovulatorio de hormona luteinizante (LH), las células de la teca y, en particular, de la capa de células de la granulosa profundamente cambian sus características morfológicas, fisiológicas y moleculares y forman el corpus de la producción de progesterona lúteo que se encarga de mantener el embarazo. Modelos de celulares de cultura son herramientas esenciales para el estudio de los mecanismos reguladores subyacentes implicados en la transformación folliculo-lútea. El protocolo presentado se centra en el procedimiento de aislamiento y criopreservación de GC bovina de folículos de tamaño pequeño a mediano (< 6 mm). Con esta técnica, puede obtenerse una población casi pura de GC. El procedimiento de criopreservación facilita enormemente el tiempo de gestión de la cultura de célula de trabajo independiente de una fuente de tejido (ovarios) de primaria directa. Este protocolo describe un modelo de cultura de célula libre de suero que imita el estado activo estradiol de GC bovina. Condiciones importantes que son esenciales para un cultivo exitoso celular activo esteroide se discuten en el protocolo. Está demostrado que aumentar la densidad de placas de las células induce una respuesta específica como lo indica una producción de perfil y de la hormona de expresión de gen alterado. Además, este modelo proporciona una base para futuros estudios sobre diferenciación de GC y otras aplicaciones.
Luteinización y ovulación exitosa dependen de alteraciones moleculares finamente afinadas y bien orquestadas en tipos de la célula folicular somáticos diversos. Puesto que los detalles de estos procesos de desarrollo no se entienden todavía completamente, más aclaración se requiere. Métodos in vivo son elaborados y costosos y, en particular, no mecanismos moleculares específicos de la dirección que se producen durante la Foliculogénesis. Por lo tanto, modelos reduccionistas en vitro se necesitan además, para proporcionar la penetración en datos de celulares y moleculares. Diferentes estudios describen la cultura de los folículos todo en el contexto de en vitro fecundación técnicas1,2,3. Porque los investigadores están interesados en los mecanismos de diferenciación, muchos estudios se centran en GC folicular. Estas células, directamente asociadas con el ovocito, son las principales fuentes de producción de estrógeno y, por lo tanto, juegan un papel esencial en la Foliculogénesis y luteinización4.
Inmortalizado células de especies diferentes se han desarrollado líneas de GC. La mayoría de ellos, sin embargo, no muestra suficiente hormona esteroide producción5. Hasta ahora, sólo uno de células de bovino que GC ha sido establecida6, pero esta línea perdió su actividad esteroidogénica después de varios pasajes7. Por lo tanto, desde la esteroidogénesis y, en particular, producción de estradiol es un rasgo esencial de la funcionalidad de la GC, es conveniente estudiar estos aspectos en modelos de cultura de célula primaria. En estudios previos, se demostró que sólo se puede observar una producción considerable de estradiol bajo condiciones de cultivo libre de suero8,9. Además, la suplementación de un precursor de la síntesis de estradiol es otro requisito previo, GC no expresan la enzima necesaria que puede convertir progesterona androstenediona10. Además, el efecto sinérgico de la FSH y el IGF-1 suplementación en vitro revelaron una actividad optimizada de la aromatasa, la enzima dominante del estradiol síntesis11. En el presente Protocolo, también se describen otros factores importantes que tienen un impacto sustancial en el modelo de cultura de la GC. En particular, la célula galjanoplastia densidad tiene enormes efectos sobre el resultado del experimento12. Además, se pudo establecer una técnica de criopreservación de GC bovina que no interfiere significativamente con la fisiología de la GC en la cultura. Esta técnica ayuda a mejorar la organización del trabajo de la cultura de célula y a optimizar la densidad de placas preferido.
El modelo de cultura de célula presentado ofrece una herramienta para analizar granulosa célula diferenciación in vitro. Varios estudios demostraron que un cultivo libre de suero es un requisito para mantener la actividad esteroide cultivada bovina GC o GC de otras especies8,9. Además, cubriendo la placa de cultivo con componentes de la matriz extracelular (p. ej., colágeno I)13, mejoró la fijación de las células considerablemente. Otra característica importante es el período de cultivo prolongado. Recientemente, se ha demostrado que una cultura a largo plazo es necesaria para obtener suficiente actividad esteroidogénica y una expresión equilibrada de granulosa célula identidad marcadores17. Parece que la GC requiere tiempo para recuperarse del estrés físico durante el procedimiento de aislamiento.
Los suplementos de los medios de comunicación FSH, IGF-1 y la androstenediona son conocidos por inducir la actividad de la aromatasa en cultivan GC. Sobre todo, los suplementos con androstenediona es absolutamente necesario, como el GC necesita un precursor para la síntesis de estradiol. Esto ha sido publicado previamente11,18 y, por lo tanto, no fue más investigado durante el presente estudio. Sin embargo, una adaptación de la FSH, IGF-1 y las concentraciones de androstenediona puede ser necesaria para otros montajes experimentales.
La técnica de criopreservación descrita aquí puede ayudar a mejorar la organización de los experimentos de cultivo de tejidos por lo que los hace más independientes de la fuente variable con los ovarios. Según pruebas previas, la criopreservación no afecta el fenotipo de GC o la producción de esteroides en la cultura. Además, la abundancia de las transcripciones de marcador en las células cultivadas no reveló diferencias significativas comparando muestras preparadas de células recién aisladas con los previamente sometidos a criopreservación16.
Un parámetro fundamental para el modelo actual de la cultura de GC es la célula placas de densidad. Como se muestra en los Resultados de representante, aumentando la densidad de placas indujo cambios notables de las características fisiológicas y moleculares. Varios genes se regulan de manera específica, que se asemejan a los cambios que son inducidos por la estimulación de la LH en vivo4,19. El hecho de que un aumento de la densidad celular puede conducir a procesos de diferenciación como en GC bovino cultivada debe considerarse meticulosamente en este modelo de GC en vitro para evitar resultados contradictorios entre repeticiones. Por lo tanto, resultados contradictorios con otros estudios podrían atribuirse a las densidades celulares diferentes y deben ser examinadas más de cerca.
El modelo de cultura descrito aquí se reveló que no responden a la LH, como los transcritos del receptor de la LHCGR están cerca del límite de detección. Por lo tanto, una simulación de la oleada de LH por igual la situación en vivo no pudo inducir diferenciación13. Sin embargo, este modelo proporciona una herramienta útil para el estudio activo estradiol GC en cultivo primario, en particular como no funcional bovinas líneas de GC existen en la actualidad.
Diferentes protocolos de tratamiento pueden probarse en el actual modelo de cultura de la GC que ayudan a desentrañar los mecanismos de regulación de la producción de esteroides o diferenciación de GC. Factores más, solos que están involucrados en procesos de desarrollo pueden analizarse por separado. Por lo tanto, este modelo de cultura proporciona una base para muchas aplicaciones diferentes.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Verónica Schreiter por su excelente asistencia técnica y modificaciones útiles del modelo de cultura de técnica y de la célula de criopreservación establecido. Además, queremos agradecer a Maren Anders y Swanhild Rodewald por su excelente asistencia técnica en el análisis posterior.
PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+ | Merck-Millipore | L 182-05 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 µg/ml) | Merck-Millipore | A 2213 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
amphotericin (250 µg/ml) | Merck-Millipore | A 2612 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
3 ml syringe (Omnifix Luer) | Braun | 4616025V | |
18 G needle | Roth | C724.1 | |
fetal calf serum | Merck-Millipore | S 0115 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
cryo-preservation vials (2 ml) | TPP Faust | TPP 89020 | |
CoolCell LX cell freezing container | Corning | 432004 | |
culture dish, 24-well, flat bottom | TPP Faust | TPP 92424 | |
collagen R (0.2 %) | Serva | 47254 | |
α-MEM | Merck-Millipore | F 0915 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
L-Glutamin (200 mM) | Merck-Millipore | K 0282 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
sodium bicarbonate | Merck-Millipore | L 1713 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
BSA | Sigma | A3311 | |
HEPES | Merck-Millipore | L 1603 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
sodium selenite | Sigma | S9133 | dissolved in sterile water |
transferrin | Sigma | T1283 | dissolved in sterile water |
insulin (10 mg/ml) | Sigma | I0516 | dissolved in 1x PBS |
NEA | Merck-Millipore | K 0293 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
FSH | Sigma | F4021 | we prefer to use a stock solution of 2 µg/ml, diluted in 0.9 % NaCl |
LR3-IGF-1 | Sigma | I1146 | we use a stock solution of 2 µg/ml, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/ml BSA |
androstenedione | Sigma | 46033 | we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol |