Här presenteras ett protokoll att undersöka de tidiga effekterna av amyloid-β (Aβ) i hjärnan. Detta visar att Aβ inducerar clathrin-medierad endocytos och kollapsen av axonal tillväxt kottar. Protokollet är användbart för att studera tidiga effekter av Aβ på axonal tillväxt kottar och kan underlätta förebyggande av Alzheimers sjukdom.
Amyloid-β (Aβ) orsakar minne nedskrivningar i Alzheimers sjukdom (AD). Även om therapeutics har visat sig minska Aβ nivåer i hjärnan hos AD patienter, förbättrar dessa inte minnesfunktioner. Sedan Aβ aggregerar i hjärnan före uppkomsten av minne nedskrivningar, kan inriktning Aβ vara ineffektiv för behandling av AD patienter som redan uppvisar minne underskott. Därför bör nedströms signalering på grund av Aβ nedfall blockeras innan AD utveckling. Aβ inducerar axonal degeneration, vilket leder till störningar av neuronala nätverk och minne nedskrivningar. Det finns många studier på mekanismer för Aβ toxicitet, förblir källan av Aβ toxicitet okänd. För att identifiera källan, föreslår vi ett nytt protokoll som använder mikroskopi, gen transfection och levande cell imaging för att undersöka tidiga förändringar orsakade av Aβ i axonal tillväxt kottar av odlade nervceller. Detta protokoll avslöjade att Aβ inducerad clathrin-medierad endocytos i axonal tillväxt kottar följt av tillväxt kon kollaps, visar att hämning av endocytos förhindrar Aβ toxicitet. Detta protokoll kommer att vara användbart i studera tidiga effekter av Aβ och kan leda till effektivare och förebyggande AD behandling.
Amyloid-β (Aβ) insättningar finns i hjärnan hos patienter med Alzheimers sjukdom (AD) och anses vara en viktig orsak till AD1 som stör neuronala nätverk, leder till minne nedskrivningar2,3,4. Många kliniska läkemedelskandidater har visat sig effektivt förhindra amyloid-β (Aβ) produktion eller ta bort Aβ insättningar. Dock har ingen lyckats förbättra minnesfunktion i AD patienter5. Aβ är redan deponerat i hjärnan före uppkomsten av minne nedskrivningar6; Därför kan minskar Aβ nivåer i hjärnan hos patienter uppvisar minne nedskrivningar vara ineffektiva. Aβ nedfall är närvarande i preklinisk AD patienter; dessa patienter närvarande dock sällan med neuronal degeneration och minne underskott6. I området i närheten finns det en tidsfördröjning mellan Aβ nedfall och minne nedskrivningar. Därför blockerar en viktig strategi för förebyggande av AD Aβ toxicitet signalering under de tidiga stadierna av AD, före utvecklingen av minne underskott. Aβ nedfall inducerar axon degeneration7,8,9,10,11,12,13, vilket kan leda till en rubbning av neurala nätverk och permanent nedsatt minne. Många studier har undersökt mekanismerna av Aβ toxicitet. till exempel har den degenererade axoner av hjärnor med AD möss visat sig ökat autofagi14. Kalcineurinhämmare aktiveringen har rapporterats som en möjlig mekanism av Aβ-inducerad axonal degeneration15; den direkt utlösande av axonal degeneration är dock fortfarande okänd.
Denna studie fokuserar på kollapsen av axonal ändelser kallas tillväxt kottar. Kollapsen av axonal tillväxt kottar kan orsakas av axonal tillväxt avskräckningsmedel, såsom semaphorin-3A och efrinreceptorkinaser-A516,17,18,19,20. Kollaps-liknande dystrofa axonal ändelser har observerats i hjärnan hos AD patienter21,22. Dessutom kan bristande tillväxt kon fungerar provocera axonal degeneration23. Det är dock okänt om Aβ inducerar tillväxt kon kollaps. Därför presenterar denna studie en roman protokoll för att observera tidiga effekterna av Aβ i odlade nervceller och undersöka Aβ-inducerad tillväxt kon kollaps.
Protokollet beskrivs i denna studie aktiverat observationen av tidig fenomen i axonal tillväxt koner efter Aβ1-42 behandling. Aβ1-42 inducerad endocytos i axonal tillväxt kottar inom 20 min och tillväxt kon kollaps observerades inom 1 h av behandling. Detta endocytos var troligen medierad av clathrin. Med hjälp av detta protokoll, bekräftades hämning av clathrin-medierad endocytos för att förhindra Aβ1-42-inducerad tillväxt kon kollaps och axonal degeneration i odlade nervceller27. Des…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete var delvis stöds av forskningsanslag från JSPS (KAKENHI 18K 07389), Japan, Takeda Science Foundation, Japan och Kobayashi Pharmaceutical Co., Ltd., Japan.
ddY mice | SLC | ||
Eight-well culture slide | Falcon | 354108 | |
poly D lysine | Wako | 168-19041 | |
Culture medium, Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
house serum | Gibco | 26050-088 | |
glucose | Wako | 049-31165 | |
L-glutamine | Wako | 074-00522 | |
0.05% trypsin | Gibco | 25300-054 | |
DNase I | Worthington | DP | |
soybean trypsin inhibitor | Gibco | 17075-029 | |
Filter with 70 µm mesh size, cell strainer | Falcon | 352350 | |
B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
CO2 incubator | Astec | SCA-165DS | |
Amyloid β1-42 | Sigma-Aldrich | A9810 | |
paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
sucrose | Wako | 196-00015 | |
Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount | polysciences | 18606-20 | |
Inverted microscope A | Carl Zeiss | Axio Observer Z1 | Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1 |
Objective Plan-Apochromat 20x | Carl Zeiss | 420650-9901 | |
Objective Plan-Apochromat 63x | Carl Zeiss | 440762-9904 | |
Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X | Nikon | ||
anti-MAP2 IgG | Abcam | ab32454 | |
anti-tau-1 IgG | Chemicon | MAB3420 | |
anti-amyloid β antibody | IBL | 10379 | clone 11A1 |
normal goat serum | Wako | 143-06561 | |
bovine serum albumin | Wako | 010-25783 | |
t-octylphenoxypolyethoxyethanol | Wako | 169-21105 | |
goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594 | Invitrogen | A11032 | |
goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
hot plate | NISSIN | NHP-M30N | |
cover glass | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
35 mm dish | IWAKI | 1000-035 | |
Silicone RTV | Shin-Etsu | KE42T | |
hand punch | Roper Whitney | No. XX | |
Fluorescence membrane probe, FM1-43FX | Invitrogen | F35355 | |
Ca2+– and Mg2+-free Hanks' balanced salt solution | Gibco | 14175-095 | |
Transfection solution, Nucleofector solution | Lonza | VPG-1001 | |
Electroporator, Nucleofector I | Amaxa | ||
Inverted microscope B | Keyence | BZ-X710 | |
Image software, ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ |