Summary
Aquí se presenta un protocolo para investigar los efectos tempranos de la amiloide-β (Aß) en el cerebro. Esto demuestra que Aβ induce la endocitosis mediada por clatrina y colapso de conos de crecimiento axonal. El protocolo es útil en el estudio de efectos tempranos de Aβ en conos de crecimiento axonal y puede facilitar la prevención de la enfermedad de Alzheimer.
Abstract
Amiloide-β (Aβ) provoca deterioro de memoria en la enfermedad de Alzheimer (AD). Aunque la terapéutica se ha demostrado para reducir los niveles de Aß en el cerebro de pacientes con EA, estos no mejoran las funciones de memoria. Ya agregados de Aβ en el cerebro antes de la aparición de deficiencias de memoria, puede ser ineficaz para el tratamiento de pacientes con EA que ya exhiben déficits de memoria contra Aβ. Por lo tanto, aguas abajo de señalización debido a la deposición de Aβ debe bloquearse antes del desarrollo de AD. Aβ induce la degeneración axonal, conduciendo a la interrupción de las redes neuronales y problemas de memoria. Aunque hay muchos estudios sobre los mecanismos de la toxicidad Aβ, la fuente de la toxicidad Aβ sigue siendo desconocida. Para ayudar a identificar la fuente, proponemos un nuevo protocolo que utiliza la microscopia, transfección génica y celular directo imágenes para investigar cambios tempranos causados por Aβ en conos de crecimiento axonal de neuronas cultivadas. Este protocolo reveló que Aβ induce la endocitosis mediada por clatrina en conos de crecimiento axonal seguida por colapso del cono de crecimiento, demostrando que la inhibición de la endocitosis previene toxicidad Aβ. Este Protocolo será útil en el estudio de los efectos tempranos de Aß y puede llevar a más eficiente y preventivo Tratamiento AD.
Introduction
Depósitos de amiloide-β (Aβ) se encuentran en el cerebro de pacientes con enfermedad de Alzheimer (EA) y se consideran una causa crítica de AD1 redes neuronales, que conduce a deficiencias de memoria2,3,4. Muchos candidatos de clínicos de drogas han demostrado para prevenir con eficacia la producción de amiloide-β (Aβ) o eliminar los depósitos Aβ. Sin embargo, no han logrado mejorar la función de memoria en pacientes de AD5. Aβ ya se deposita en el cerebro antes de la aparición de deficiencias de memoria6; por lo tanto, disminuyendo los niveles de Aß en el cerebro de los pacientes que exhiben problemas de memoria pueden ser ineficaces. Depósito de Aß está presente en pacientes con EA preclínicos; sin embargo, estos pacientes rara vez presentan neuronal degeneración y memoria déficit de6. Hay un desfase de tiempo entre el depósito de Aß y debilitaciones de la memoria. Por lo tanto, una estrategia fundamental para la prevención de la EA está bloqueando la toxicidad Aβ señalización durante las etapas tempranas de la EA, antes del desarrollo de déficits de la memoria. Depósito de Aβ induce axon degeneración7,8,9,10,11,12,13, que puede conducir a una interrupción de redes neuronales y debilitación permanente de la función de memoria. Muchos estudios han investigado los mecanismos de la toxicidad Aβ; por ejemplo, los axones degenerados de los cerebros de ratones AD han demostrado aumentaron autofagia14. Activación de la calcineurina se ha divulgado como un posible mecanismo de degeneración axonal inducida por Aß15; sin embargo, la activación directa de la degeneración axonal sigue siendo desconocido.
Este estudio se centra en el colapso de las terminaciones axonales llamados conos de crecimiento. El colapso de conos de crecimiento axonal puede ser causado por repelentes de crecimiento axonal, como Semaforina 3A y efrina-A516,17,18,19,20. Colapso-como distróficos terminales axonales se han observado en los cerebros de pacientes de AD21,22. Además, un fallo de funcionamiento de cono de crecimiento puede provocar degeneración axonal23. Sin embargo, se desconoce si Aβ induce colapso del cono de crecimiento. Por lo tanto, este estudio presenta un nuevo protocolo para observar los primeros efectos del Aß en neuronas cultivadas e investigar el colapso del cono de crecimiento inducida por Aß.
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Protocol
Todos los experimentos se llevaron a cabo con arreglo a las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio en el Campus de la Universidad de Toyama de Sugitani y fueron aprobados por el Comité para el cuidado Animal y uso de animales de laboratorio en el Sugitani Campus de la Universidad de Toyama (A2014INM-1, A2017INM-1).
1. colapso ensayo
- Capa de Poly-D-lisina
- Capa de diapositivas 8-bien cultura con 400 μL de 5 μg/mL poly-D-lisina (PDL) en tampón fosfato salino (PBS) e incube a 37 ° C durante la noche.
- Retirar la solución PDL y lavar los pocillos 3 veces con agua destilada.
- Neurona cultura24
- Mince recientemente aisladas cortezas cerebrales de los ratones de ddY (E14) 14 día embrionario con microscissors en medio de cultivo de neuronas que contiene suero de caballo de 12%, 0.6% de glucosa y 2 mM L-glutamina (medio A). No añadir antibióticos.
Nota: En el presente Protocolo, se utiliza el ratón ddY. Se trata de una cepa exogámica de uso general en Japón. Este protocolo de cultura de la neurona puede ser aplicado también para las neuronas corticales de rata7,25. - Centrifugue los tejidos 87 x g durante 3 minutos.
- Eliminar el sobrenadante. Luego el precipitado, añadir 2 mL de tripsina 0,05% e incubar por 15 min a 37° C. Mezclar golpeando cada 5 min.
- Añadir 4 mL de medio A y mezcla golpeando.
- Centrifugue los tejidos 178 x g durante 3 minutos.
- Quite el sobrenadante e incubar los tejidos con 600 U/mL la ADNasa I y el inhibidor de tripsina de soja de 0,3 mg/mL disuelta en PBS durante 15 min a 37 ° C. Mezclar golpeando cada 5 min.
- Después de la incubación, agregar 4 mL de medio A y mezcla golpeando.
- Centrifugue los tejidos 178 x g durante 3 minutos.
- Después de retirar el sobrenadante, agregar 4 mL de medio A y triturate los tejidos con una pipeta Pasteur pulido.
- Los tejidos triturados con una malla de 70 μm tamaño de poro del filtro. Después de la filtración, calcular la densidad de las células con un hemocitómetro.
- Cultura de las células en la cultura 8-bien desliza a 0.8 x 104 células/pozo con medio A y mantienen en un incubador de CO2 con un ambiente humidificado de 10% de CO2 a 37 ° C.
- Después de 4 h de cultivo, sustituir el medio de cultivo para un suplemento que contiene de 2% de cultura neuronal, 0.6% de glucosa y 2 mM L-glutamina (medio B).
Nota: La pureza de las neuronas fue aproximadamente el 75%, como se describió anteriormente26.
- Mince recientemente aisladas cortezas cerebrales de los ratones de ddY (E14) 14 día embrionario con microscissors en medio de cultivo de neuronas que contiene suero de caballo de 12%, 0.6% de glucosa y 2 mM L-glutamina (medio A). No añadir antibióticos.
- Ensayo de colapso27
- Disolver obtenidos comercialmente integral amiloide β1-42 (Aβ1-42) en agua destilada a una concentración de 0.5 mM e incube a 37 ° C durante 7 días. Después de la incubación, guarde la solución agregada de Aβ1-42 en un congelador de-30 ° C hasta su uso.
Nota: La incubación es necesaria para la agregación y la toxicidad del Aβ27,28,29,30. - Después de 4 días de cultivo neuronal, tratar los pocillos con 100 μL de nuevo B medio, que contiene 0,5 μM había agregado solución Aβ1-42 o vehículo (agua destilada) por 1 h.
Nota: Efectos de Aβ1-42 fueron dosis-dependiente aumentó de 0,1 a 5 μM y alcanzó el 0,5 μM como se describió anteriormente27. Resultados similares se observan cuando por tratamiento Aβ1-42 para 1 h después de 3 días de cultivo neuronal31. - Retire el medio de cultivo y fijar inmediatamente las neuronas con paraformaldehído al 4% que contiene sacarosa 4% en PBS por 1 h a 37 ° C en una placa caliente.
- Después de la fijación, lavar las neuronas 3 veces con PBS y montar con un medio de montaje acuoso. Seca el medio de montaje a 4 ° C durante 2 a 4 días.
- Captura toda la zona (7.8 x 9 mm2) de cada bien con un 20 X objetivo seco en un microscopio invertido.
- Clasificar el más largo neurites de cada neurona en etapa 3 o 4 como axones, como se describió anteriormente32,33.
- Clasificar conos de crecimiento según los siguientes criterios: conos de crecimiento 1) axonal se consideran falta lamellipodia o 2) que poseen menos de tres filopodios derrumbaron conos de crecimiento, como se describió anteriormente17.
Nota: Conos de crecimiento saludable se anotaron como punto 0; conos de crecimiento colapsado se anotaron como 1 punto. Significa colapso puntuaciones se calculan para cada tratamiento.
- Disolver obtenidos comercialmente integral amiloide β1-42 (Aβ1-42) en agua destilada a una concentración de 0.5 mM e incube a 37 ° C durante 7 días. Después de la incubación, guarde la solución agregada de Aβ1-42 en un congelador de-30 ° C hasta su uso.
2. amiloide β inmunotinción
- La cultura las neuronas corticales de ratón por 3 días, como se describe en el paso 1.2.
- Tratar con agregados Aβ1-42 (5 μM) o vehículo durante 4 h a 37 ° C en un incubador de CO2 .
- Sin quitar el medio, agregar un volumen igual de paraformaldehído al 4% que contiene sacarosa al 4% en PBS a cada pocillo y mantener el cultivo a 37 ° C sobre una placa caliente durante 5 minutos.
- Reemplazar la solución con 400 μL de paraformaldehído al 4% que contiene sacarosa al 4% en PBS y mantener a 37 ° C en la placa durante 1 hora. Este protocolo de fijación se modificó de un anterior informe34.
- Lavar las neuronas 3 veces con PBS.
- Bloque con 5% de suero normal de cabra en PBS.
- Incubar las neuronas con inmunoglobulina de ratón anti-amiloide β G (IgG) (1:50) y 1% albúmina de suero bovino en PBS a 4 ° C durante la noche.
- Lavar las neuronas 3 veces con PBS.
- Incubar las neuronas con un anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia (1: 400) y 1% albúmina de suero bovino en PBS a temperatura ambiente durante 2 h.
- Lavar las neuronas 3 veces con PBS y montar con un medio de montaje acuoso.
- Captura de imágenes de fluorescencia e imágenes de campo claro con iluminación oblicua utilizando una lente de objetivo seco 40 X en microscopio invertido B.
3. axonal Immunostaining27
- Lavar las neuronas 3 veces con PBS después de la fijación de neuronas cultivadas, como se describe en el paso 1.3.3.
- Incubar las neuronas de ratón anti-tau-1 IgG (1: 500), proteína asociada los microtúbulos de conejo 2 (MAP2) IgG (1: 500) en 5% de suero normal de cabra y 0.3% t- octylphenoxypoly-Etoxietanol en PBS a 4 ° C durante la noche.
- Lavar las neuronas 3 veces con PBS.
- Incubar las neuronas con anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia (1: 400) y 0.3% t- octylphenoxypolyethoxyethanol en PBS a temperatura ambiente durante 2 h.
- Lavar las neuronas 3 veces con PBS y Monte utilizando un medio de montaje acuoso.
- Capturar imágenes de contraste (DIC) de interferencia diferencial y fluorescencia usando una lente de objetivo seco de 20 × a. microscopio invertido
4. vivo de la célula imagen27
- Capa de platos a base de vidrio con 500 μL de PDL (5 μg/mL), como se describe en el paso 1.1.1.
Nota: En este protocolo, se utilizaron los platos caseros basados en vidrio. Platos a base de vidrio disponibles en el mercado pueden utilizarse también para la proyección de imagen vivo. Platos caseros basados en vidrio se prepararon como sigue: 1) hacer un agujero aproximadamente 1,4 mm de diámetro en el centro de un plato de 35 mm con un golpe de mano y 2) Coloque un cubreobjetos de vidrio (diámetro de 22 mm) en la parte posterior del plato con silicona. - Lavar las placas con agua destilada, como se describe en el paso 1.1.2 y la cultura de las neuronas corticales en el plato a base de vidrio en 3 x 104 células/plato con un medio, como se describe en el paso 1.2.
- Después de 4 días de cultivo celular, sustituir el medio con 2 mL de nuevo medio B y la transferencia el plato invertido microscopio A. mantener la cultura en un ambiente humidificado de 10% de CO2 a 37 ° C.
5. endocitosis experimento
- Las neuronas corticales de ratón de la cultura como se describe en el paso 1.2.
- Cuatro días más tarde, sustituir el medio con 100 μL de medio nuevo B que contiene 20 sonda de membrana μM fluorescencia durante 1 minuto.
- Añadir 1 μL de 0.05 mM agregado Aβ1-42 (final 0.5 μM) o vehículo (agua destilada) solución y mezclar mediante pipeteo. Incubar por 20 min.
- Quite el medio y lavar los pocillos dos veces con medio B que ha sido precalentado a 37 ° C.
- Fijar, lavar y montar las neuronas como se describe en los pasos 1.3.3 y 1.3.4.
- Captura de fluorescentes y DIC imágenes con 63 X aceite objetivo lente microscopio invertido a.
- Cuantificar la densidad de la zona de punta de prueba positiva membrana de fluorescencia en cada cono de crecimiento sano mediante un software de imagen.
6. transfección gen
- Preparar las neuronas corticales como se describe en el paso 1.2. Después de completar los pasos 1.2.1 a 1.2.10, Centrifugue las neuronas a 178 x g durante 3 minutos.
- Eliminar el sobrenadante, agregar 4 mL de Ca2 +-libre y Mg2 +-libre de solución salina equilibrada de Hanks (HBSS de CMF) y mezclar mediante pipeteo.
- Centrifugar las células a 178 x g durante 3 minutos.
- Eliminar el sobrenadante, agregar 4 mL de CMF-HBSS y mezclar mediante pipeteo. A continuación, calcular la densidad celular, como se describe en el paso 1.2.10.
- Transferencia de 5 x 106 células a un tubo de 1.5 mL y centrifugar a 1.677 x g durante 1 minuto.
- Eliminar el sobrenadante, agregar 100 μL de solución de transfección con suplemento y 3 μg de plásmido de DNA codificación EGFP o EGFP AP180 c-terminal y mezclar mediante pipeteo.
- Transferir la solución anterior (paso 6.6) a una cubeta certificada y transfectar con un electroporator, según protocolo del fabricante.
- Inmediatamente después de la transfección, Añadir 500 μL de medio A en la cubeta y transferir la solución a un tubo de 1,5 mL con una pipeta de certificados. A continuación, calcular la densidad celular, como se describe en el paso 1.2.10.
- La cultura las células en un portaobjetos bien 8 cultura 0.8 x 104 células/pozo, como se describe en los pasos 1.2.11 y 1.2.12.
- Después de 4 días de cultivo celular, realice un ensayo de colapso como se describe en el paso 1.3.
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Representative Results
En este protocolo, Aβ1-42 se incubó a 37 ° C durante 7 días antes de su uso, porque incubación de Aβ1-42 era necesaria para la producción de formas tóxicas27,28,30,35. Después de la incubación, se observaron formas agregadas de Aβ (figura 1A). Se ha divulgado que incubación similar de Aβ1-42 produjo la forma de fibrilla de Aβ36. Después del tratamiento con este agregado Aβ1-42, immunostaining con un anticuerpo para el oligómero tóxicos de Aβ35,37 fue realizado, y la coloración positiva se detectó en neuronas cultivadas (figura 1B). Teniendo en cuenta lo anterior, este protocolo de incubación produce las formas tóxicas de Aβ.
Varios días fueron requeridos para la inducción de la degeneración axonal después de la exposición Aβ. No quedan claros los acontecimientos antes de la degeneración axonal. Por lo tanto, este protocolo ha sido desarrollado para comprender aún más los mecanismos implicados. Mediante este protocolo, se analizaron los fenómenos tempranos inducidos por tratamiento de Aβ. Neuronas corticales fueron cultivadas durante 4 días. El más largo neurites en neuronas cultivadas fueron identificados como axones; Estos fueron confirmados por immunostaining positivo para el immunostaining negativo para el marcador dendrítico, MAP2, marcador axonal y tau-1 (figura 2). Después de 1 h de tratamiento de vehículos, conos de crecimiento tenían extensión lamellipodia y procesados varios filopodios. Estos fueron identificados como conos de crecimiento saludable. Por el contrario, 1 h de tratamiento Aβ1-42 condujo a conos de crecimiento disminuida, que no se convirtió lamellipodia o filopodios. Estos fueron identificados como conos de crecimiento colapsado. Partituras de colapso se calcularon como se describe en el paso 1.3.7. Cuando formas de conos de crecimiento eran poco claros, fueron eliminados del análisis. Tratamiento de Aβ1-42 llevó a un aumento significativo en la puntuación de colapso, correspondiente a la mayor caída de crecimiento axonal, en comparación con la puntuación de colapso del crecimiento tratados con vehículo conos27.
Conos de crecimiento axonal fueron observados antes y después del tratamiento con Aβ1-42 (figura 3). Las células se mantuvieron en el microscopio invertido con un ambiente humidificado de 10% de CO2 a 37 ° C. Imágenes fueron capturadas cada 5 min. Como se muestra en la figura 3, conos de crecimiento se desplomó entre 21 y 26 min después del tratamiento de Aβ1-42. Se excluyeron los conos de crecimiento de celular directo imágenes si no conservan su forma saludable durante 1 hora antes de cualquier tratamiento.
Para visualizar los efectos tempranos de Aβ1-42-tratamiento, endocitosis fue utilizado como el foco de este análisis, porque los inhibidores de la endocitosis pueden bloquear de colapso del cono de crecimiento Aβ1-42-inducida27. Endocitosis fue visualizado con una sonda de fluorescencia membrana (es decir., un colorante fluorescente que se une a las membranas de plasma y espontáneamente es endocytosed). Un estudio anterior demostró que conos de crecimiento no colapso en 20 min después de Aβ1-42-tratamiento27; por lo tanto, conos de crecimiento sanos fueron seleccionados por DIC la proyección de imagen en vehículo o Aβ1-42-tratados las células después de 20 minutos. Tras Aβ1-42-tratamiento, se observaron numerosos fluorescente membrana sonda positiva puncta en el cono de crecimiento (figura 4). La densidad de fluorescencia membrana sonda positiva puncta en conos de crecimiento fue significativamente mayor27. Esto sugiere que endocitosis del cono de crecimiento Aβ1-42-inducida ocurre antes del colapso.
Para confirmar el papel de la endocitosis, un plásmido de ADN codificación EGFP AP180 c-término era transfected en neuronas corticales cultivadas. Las células que expresan el C-terminal de AP180 selectivamente inhiben la endocitosis mediada por clatrina38,39. Si la expresión de EGFP fue observada en el cuerpo celular de la neurona, el c-término AP180 consideró a expresarse en el cono de crecimiento axonal de las neuronas. Transfección de AP180 c-terminal bloquea crecimiento Aβ1-42-induced cono colapso (figura 5)27.
Figura 1 : Incubación de un Β1-42 agregados de Aβ. Aβ1-42 (A) fue disuelto en agua destilada a una concentración de 0,5 mM y se incubó a 37 ° C durante 7 días (después de la incubación) o almacenada a-30 ° C sin incubación (no incubación). Cada solución Aβ se diluyó hasta 0,1 mM; entonces, 10 μL de cada solución diluida era caído en portaobjetos de vidrio y cubierta con cubreobjetos. Imágenes de campo brillante con iluminación oblicua se capturaron utilizando microscopio invertido B. escala de la barra = 20 μm. (B) tratamiento agregado Aβ1-42 o vehículo en neuronas cultivadas durante 4 horas. Después del tratamiento, se fijaron las neuronas y immunostained para tóxicos oligómeros de Aß. Imágenes de fluorescencia (rojo) y se muestran imágenes de campo claro con iluminación oblicua (gris). Barra de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : A Colapso del cono de crecimiento axonal inducida por β1-42. Después Aβ1-42 - o vehículo-del tratamiento, las neuronas se fijaron y immunostained para tau-1 (rojo) y microtúbulos asociados proteína 2 (MAP2, verde). Se muestran imágenes de contraste (DIC) de interferencia diferencial y fluorescencia. Vista ampliada de las regiones de interés (ROI, rectángulos) se muestra a continuación las imágenes correspondientes. Blanco escala bares = 50 μm; negro barras de escala = 10 μm. Esta figura ha sido modificada de Kuboyama et al, 201527. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Vive la proyección de imagen de la célula antes y después de A Tratamiento de β1-42. Después de 4 días de cultivo, las células se transfirieron a un microscopio invertido y se capturaron imágenes DIC cada 5 minutos se muestran imágenes de lapso de tiempo. Los dígitos representan a minutos: segundos después de la aplicación de agregados Aβ1-42 (concentración final, 0.5 μM). Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Veinte minutos de la A Endocitosis inducida por el tratamiento de β1-42. Neuronas corticales fueron cultivadas durante 4 días y trataron con una sonda de membrana de fluorescencia. Entonces, las neuronas fueron tratadas durante 20 min con Aβ1-42 o vehículo. Se muestran imágenes de fluorescencia de los conos de crecimiento. Las líneas amarillas punteadas representan los contornos de los conos de crecimiento. Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Expresión de terminus AP180-C bloquea el colapso inducido por Aβ1-42. Cuatro días después de la transfección de EGFP (A, B) o EGFP AP180 c-terminal (C, D); Aβ1-42 (B, D) o vehículo (A, C) se agrega a las neuronas corticales para h. 1 DIC (paneles superiores) y se muestran imágenes de fluorescencia (paneles inferiores). Las flechas indican los conos de crecimiento. Barras de la escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo descrito en este estudio permitió la observación de fenómenos tempranos en conos de crecimiento axonal Aβ1-42 postratamiento. Aβ1-42 inducida por endocitosis en conos de crecimiento axonal dentro de 20 min, y colapso del cono de crecimiento se observó dentro de 1 h de tratamiento. Esta endocitosis fue probablemente mediada por clatrina. Mediante este protocolo, se confirmó la inhibición de la endocitosis mediada por clatrina para evitar el colapso del cono de Aβ1-42-inducida por el crecimiento y degeneración axonal de las neuronas cultivadas27. Además, la inhibición de la endocitosis mediada por clatrina atenuados Aβ1-42-inducida de la degeneración axonal y déficits de memoria en vivo27. Estos resultados indican que endocitosis mediada por clatrina es una avenida terapéutica prometedora para la prevención de AD.
Este protocolo fue desarrollado de colapso ensayos para repelentes de crecimiento axonal, como Semaforina 3A y efrina-A516,17,18,19,20. Ensayos de colapso se han utilizado en estudios que evaluaron el desarrollo de redes neuronales. He demostrado que este protocolo se puede aplicar a los análisis patológicos, particularmente aquellos que involucran mecanismos de AD; sin embargo, una limitación puede ser que aproximadamente el 40% de los conos de crecimiento se desplomó en la condición sana. Este porcentaje es mayor que los resultados de neuronas ganglionares cultivadas de raíz dorsal, que más comúnmente se utilizan en colapsan ensayos16,17,18,19,20. Por lo tanto, la diferencia en tipos de células podría estar relacionada con diferencias en las tasas de caída. Las proporciones de colapso encontradas en este estudio fueron consistentes con los encontrados en estudios anteriores con las neuronas corticales cultivadas normal40,41. Además, Aβ1-42 inducida por niveles similares de colapso del cono de crecimiento en comparación con otros factores de colapso, como Semaforina 3A y efrina-A527. Por lo tanto, este protocolo es válido para la cuantificación del colapso del cono de crecimiento Aβ1-42-inducida. Este protocolo de fijación es importante para mantener la forma de conos de crecimiento. Si las células se fijaron convencionalmente con paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente, más conos de crecimiento pueden han colapsado debido al procedimiento de fijación (datos no mostrados). Por otra parte, glutaraldehído y la fijación de topes están disponibles para fijación rígida, como se describió anteriormente42; sin embargo, glutaraldehído presenta autofluorescencia, que es un impedimento importante para la proyección de imagen de fluorescencia.
Un estudio reciente con el mismo protocolo demostró que el extracto de agua de Radix Polygalae (raíces de Polygala tenuifolia) inhibe la endocitosis Aβ1-42-inducido en neuronas cultivadas, previno la degeneración axonal y reducido el déficit de memoria en un modelo de ratón transgénico de AD31. Un nuevo candidato para la prevención de AD se ha encontrado con este protocolo. Una combinación de transfección génica y celular directo imágenes en este protocolo podría mostrar los eventos celulares encontrados en los axones y sus terminales antes y después del tratamiento de Aβ, tales como Ca2 + proyección de imagen dinámica microtubular y dinámica de adhesión celular, que están al parecer relacionados con axonal crecimiento43,44,45. Este protocolo puede ayudar a revelar más mecanismos de la toxicidad Aβ y puede ayudar a conducir a la prevención y/o tratamiento de la EA.
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Disclosures
El autor no tiene nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue parcialmente apoyado por becas de investigación de JSP (KAKENHI 18K 07389), Japón, Fundación Ciencia de Takeda, Japón y Kobayashi Pharmaceutical Co., Ltd., Japón.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ddY mice | SLC | ||
| Eight-well culture slide | Falcon | 354108 | |
| poly D lysine | Wako | 168-19041 | |
| Culture medium, Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| house serum | Gibco | 26050-088 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| L-glutamine | Wako | 074-00522 | |
| 0.05% trypsin | Gibco | 25300-054 | |
| DNase I | Worthington | DP | |
| soybean trypsin inhibitor | Gibco | 17075-029 | |
| Filter with 70 µm mesh size, cell strainer | Falcon | 352350 | |
| B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| CO2 incubator | Astec | SCA-165DS | |
| Amyloid β1-42 | Sigma-Aldrich | A9810 | |
| paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| sucrose | Wako | 196-00015 | |
| Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount | polysciences | 18606-20 | |
| Inverted microscope A | Carl Zeiss | Axio Observer Z1 | Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1 |
| Objective Plan-Apochromat 20x | Carl Zeiss | 420650-9901 | |
| Objective Plan-Apochromat 63x | Carl Zeiss | 440762-9904 | |
| Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X | Nikon | ||
| anti-MAP2 IgG | Abcam | ab32454 | |
| anti-tau-1 IgG | Chemicon | MAB3420 | |
| anti-amyloid β antibody | IBL | 10379 | clone 11A1 |
| normal goat serum | Wako | 143-06561 | |
| bovine serum albumin | Wako | 010-25783 | |
| t-octylphenoxypolyethoxyethanol | Wako | 169-21105 | |
| goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594 | Invitrogen | A11032 | |
| goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| hot plate | NISSIN | NHP-M30N | |
| cover glass | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| 35 mm dish | IWAKI | 1000-035 | |
| Silicone RTV | Shin-Etsu | KE42T | |
| hand punch | Roper Whitney | No. XX | |
| Fluorescence membrane probe, FM1-43FX | Invitrogen | F35355 | |
| Ca2+- and Mg2+-free Hanks' balanced salt solution | Gibco | 14175-095 | |
| Transfection solution, Nucleofector solution | Lonza | VPG-1001 | |
| Electroporator, Nucleofector I | Amaxa | ||
| Inverted microscope B | Keyence | BZ-X710 | |
| Image software, ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ |
References
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