Summary
Här presenteras ett protokoll att undersöka de tidiga effekterna av amyloid-β (Aβ) i hjärnan. Detta visar att Aβ inducerar clathrin-medierad endocytos och kollapsen av axonal tillväxt kottar. Protokollet är användbart för att studera tidiga effekter av Aβ på axonal tillväxt kottar och kan underlätta förebyggande av Alzheimers sjukdom.
Abstract
Amyloid-β (Aβ) orsakar minne nedskrivningar i Alzheimers sjukdom (AD). Även om therapeutics har visat sig minska Aβ nivåer i hjärnan hos AD patienter, förbättrar dessa inte minnesfunktioner. Sedan Aβ aggregerar i hjärnan före uppkomsten av minne nedskrivningar, kan inriktning Aβ vara ineffektiv för behandling av AD patienter som redan uppvisar minne underskott. Därför bör nedströms signalering på grund av Aβ nedfall blockeras innan AD utveckling. Aβ inducerar axonal degeneration, vilket leder till störningar av neuronala nätverk och minne nedskrivningar. Det finns många studier på mekanismer för Aβ toxicitet, förblir källan av Aβ toxicitet okänd. För att identifiera källan, föreslår vi ett nytt protokoll som använder mikroskopi, gen transfection och levande cell imaging för att undersöka tidiga förändringar orsakade av Aβ i axonal tillväxt kottar av odlade nervceller. Detta protokoll avslöjade att Aβ inducerad clathrin-medierad endocytos i axonal tillväxt kottar följt av tillväxt kon kollaps, visar att hämning av endocytos förhindrar Aβ toxicitet. Detta protokoll kommer att vara användbart i studera tidiga effekter av Aβ och kan leda till effektivare och förebyggande AD behandling.
Introduction
Amyloid-β (Aβ) insättningar finns i hjärnan hos patienter med Alzheimers sjukdom (AD) och anses vara en viktig orsak till AD1 som stör neuronala nätverk, leder till minne nedskrivningar2,3,4. Många kliniska läkemedelskandidater har visat sig effektivt förhindra amyloid-β (Aβ) produktion eller ta bort Aβ insättningar. Dock har ingen lyckats förbättra minnesfunktion i AD patienter5. Aβ är redan deponerat i hjärnan före uppkomsten av minne nedskrivningar6; Därför kan minskar Aβ nivåer i hjärnan hos patienter uppvisar minne nedskrivningar vara ineffektiva. Aβ nedfall är närvarande i preklinisk AD patienter; dessa patienter närvarande dock sällan med neuronal degeneration och minne underskott6. I området i närheten finns det en tidsfördröjning mellan Aβ nedfall och minne nedskrivningar. Därför blockerar en viktig strategi för förebyggande av AD Aβ toxicitet signalering under de tidiga stadierna av AD, före utvecklingen av minne underskott. Aβ nedfall inducerar axon degeneration7,8,9,10,11,12,13, vilket kan leda till en rubbning av neurala nätverk och permanent nedsatt minne. Många studier har undersökt mekanismerna av Aβ toxicitet. till exempel har den degenererade axoner av hjärnor med AD möss visat sig ökat autofagi14. Kalcineurinhämmare aktiveringen har rapporterats som en möjlig mekanism av Aβ-inducerad axonal degeneration15; den direkt utlösande av axonal degeneration är dock fortfarande okänd.
Denna studie fokuserar på kollapsen av axonal ändelser kallas tillväxt kottar. Kollapsen av axonal tillväxt kottar kan orsakas av axonal tillväxt avskräckningsmedel, såsom semaphorin-3A och efrinreceptorkinaser-A516,17,18,19,20. Kollaps-liknande dystrofa axonal ändelser har observerats i hjärnan hos AD patienter21,22. Dessutom kan bristande tillväxt kon fungerar provocera axonal degeneration23. Det är dock okänt om Aβ inducerar tillväxt kon kollaps. Därför presenterar denna studie en roman protokoll för att observera tidiga effekterna av Aβ i odlade nervceller och undersöka Aβ-inducerad tillväxt kon kollaps.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment genomfördes i enlighet med riktlinjerna för vård och användning av försöksdjur vid universitetet i Toyama Sugitani Campus och godkändes av kommittén för djur vård och användning av försöksdjur på Sugitani Campus den Universitetet i Toyama (A2014INM-1, A2017INM-1).
1. kollaps Assay
- Poly-D-lysin beläggning
- Kappa 8-väl kultur bilder med 400 μL av 5 μg/mL poly-D-lysin (PDL) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och inkubera vid 37 ° C dem över natten.
- Ta bort PDL lösningen och Tvätta brunnarna 3 gånger med destillerat vatten.
- Neuron kultur24
- Finhacka färsk isolerade cerebral cortices från embryonala dag 14 (E14) ddY möss med microscissors i neuron odlingsmedium som innehåller 12% häst serum, 0,6% glukos och 2 mM L-glutamin (medium A). Lägg inte antibiotika.
Obs: I detta protokoll, ddY musen används. Detta är en outbred stam som vanligen används i Japan. Detta neuron kultur protokoll kan också tillämpas för råtta kortikala nervceller7,25. - Centrifugera vävnader vid 87 x g i 3 min.
- Ta bort supernatanten. Sedan att pelleten, tillsätt 2 mL av 0,05% trypsin och inkubera i 15 minuter vid 37° C. Blanda genom att trycka på varje 5 min.
- Tillsätt 4 mL medium A och blanda genom att trycka på.
- Centrifugera vävnader vid 178 x g i 3 min.
- Avlägsna supernatanten och inkubera vävnader med 600 U/mL DNAS jag och 0,3 mg/mL sojabönor trypsin hämmare upplöst i PBS under 15 minuter vid 37 ° C. Blanda genom att trycka på varje 5 min.
- Efter inkubation, tillsätt 4 mL medium A och blanda genom att trycka på.
- Centrifugera vävnader vid 178 x g i 3 min.
- Efter bort supernatanten, tillsätt 4 mL medium A och pulverisera vävnader med en polerad Pasteur-pipett.
- Filtrera triturated vävnader med en 70 µm porstorlek mesh. Efter filtrering, beräkna densiteten av celler med en hemocytometer.
- Kultur cellerna i kulturens 8-väl glida vid 0,8 x 104 celler per brunn med medium A och underhålla dem i en CO2 inkubator med en fuktad atmosfär av 10% CO2 vid 37 ° C.
- Efter 4 h av odling, ersätta odlingssubstratet till en innehållande 2% tillägg för neuronal kultur, 0,6% glukos och 2 mM L-glutamin (medium B).
Obs: Renhet av nervceller var ca 75%, som tidigare beskrivits26.
- Finhacka färsk isolerade cerebral cortices från embryonala dag 14 (E14) ddY möss med microscissors i neuron odlingsmedium som innehåller 12% häst serum, 0,6% glukos och 2 mM L-glutamin (medium A). Lägg inte antibiotika.
- Kollaps assay27
- Lös upp kommersiellt erhålls fullängds amyloid β1-42 (Aβ1-42) i destillerat vatten vid en koncentration av 0,5 mM och inkubera vid 37 ° C i 7 dagar. Efter inkubering, förvaras den aggregerade Aβ1-42-lösningen i-30 ° C frys fram till användning.
Obs: Denna inkubation är nödvändigt för aggregering och toxicitet av Aβ27,28,29,30. - Efter 4 dagar av neuronala kultur, behandla brunnarna med 100 μL av nya medium B, aggregerade som innehåller 0,5 μM Aβ1-42 eller fordon lösning (destillerat vatten) för 1 h.
Obs: Effekterna av Aβ1-42 var dosberoende ligandinducerad ökas från 0,1 till 5 μM, och nådde som högst 0,5 μM som tidigare beskrivits27. Liknande resultat kan observeras när av Aβ1-42 behandling för 1 h efter 3 dagar av neuronala kultur31. - Ta bort odlingsmediet och omedelbart åtgärda nervceller med 4% PARAFORMALDEHYD som innehåller 4% sackaros i PBS för 1 h vid 37 ° C på en värmeplatta.
- Efter fixering, tvätta nervceller 3 gånger med PBS och montera dem med en vattenlösning monteringsmedium. Torka monteringsmedium vid 4 ° C i 2 – 4 dagar.
- Fånga hela området (7,8 x 9 mm2) för varje brunn med en 20 X torr objektiv på en inverterade Mikroskop.
- Klassificera den längsta neuriter varje neuron i stadium 3 eller 4 som axoner, som tidigare beskrivits32,33.
- Klassificera tillväxt kottar enligt följande kriterier: 1) axonal tillväxt kottar saknas lamellipodia eller 2) som har färre än tre filopodia anses kollapsade tillväxt kottar, som tidigare beskrivits17.
Obs: Sund tillväxt kottar poängsätts 0 punkt; kollapsade tillväxt kottar poängsätts som 1 Poäng. Innebära kollaps score beräknas för varje behandling.
- Lös upp kommersiellt erhålls fullängds amyloid β1-42 (Aβ1-42) i destillerat vatten vid en koncentration av 0,5 mM och inkubera vid 37 ° C i 7 dagar. Efter inkubering, förvaras den aggregerade Aβ1-42-lösningen i-30 ° C frys fram till användning.
2. amyloid β immunfärgning
- Kultur mus kortikala neuroner i 3 dagar, enligt beskrivningen i steg 1.2.
- Behandla med aggregerade Aβ1-42 (5 μM) eller fordon för 4 h vid 37 ° C i en CO2 inkubator.
- Utan att ta bort mediet, tillsätt en motsvarande volym av 4% PARAFORMALDEHYD som innehåller 4% sackaros i PBS till varje brunn och underhålla kulturen vid 37 ° C på en värmeplatta för 5 min.
- Ersätta lösningen med 400 μL av 4% PARAFORMALDEHYD som innehåller 4% sackaros i PBS och underhålla vid 37 ° C på den varma plattan för 1 h. Denna fixering protokollet ändrades från en tidigare rapport34.
- Tvätta nervcellerna 3 gånger med PBS.
- Blockera med 5% normala get serum i PBS.
- Inkubera i nervceller med musen anti amyloid β immunglobulin G (IgG) (1:50) och 1% bovint serumalbumin i PBS vid 4 ° C över natten.
- Tvätta nervcellerna 3 gånger med PBS.
- Inkubera nervceller med fluorescens-konjugerad sekundär antikropp (1: 400) och 1% bovint serumalbumin i PBS i rumstemperatur i 2 h.
- Tvätta nervcellerna 3 gånger med PBS och montera dem med en vattenlösning monteringsmedium.
- Fånga fluorescens och ljusa fält bilder med sned belysning med en 40 X torr objektiv på inverterade Mikroskop B.
3. axonal immunfärgning27
- Tvätta nervcellerna 3 gånger med PBS efter odlade neuron fixering, som beskrivs i steg 1.3.3.
- Inkubera nervceller med musen anti-tau-1 IgG (1: 500), kanin anti mikrotubulära associerade protein 2 (MAP2) IgG (1: 500) i 5% normala get serum och 0,3% t- octylphenoxypoly-ethoxyethanol i PBS vid 4 ° C över natten.
- Tvätta nervcellerna 3 gånger med PBS.
- Inkubera nervceller med fluorescens-konjugerad sekundära antikroppar (1: 400) och 0,3% t- octylphenoxypolyethoxyethanol i PBS i rumstemperatur i 2 h.
- Tvätta nervcellerna 3 gånger med PBS och montera med hjälp av ett vattenhaltigt monteringsmedium.
- Fånga fluorescens och differential störningar bilder med kontrast (DIC) med hjälp av en 20 × torr objektiv på inverterade mikroskopet A.
4. levande Cell Imaging27
- Täck glas-baserade rätter med 500 μL av PDL (5 μg/mL), som beskrivs i steg 1.1.1.
Obs: I detta protokoll användes hemmagjord glass-baserade rätter. Kommersiellt tillgängliga glas-baserade rätter kan också användas för levande avbildning. Hemmagjord glass-baserade rätter var beredd på följande sätt: 1) göra ett hål ca 1,4 mm i diameter i mitten av en 35 mm maträtt med en hand punch, och 2) bifoga ett täckglas (diameter 22 mm) på baksidan av skålen med silikon. - Tvätta plattorna med destillerat vatten, som beskrivs i steg 1.1.2 och kultur kortikala nervceller i glas-baserade skålen på 3 x 104 celler/maträtt med medellång A, som beskrivs i steg 1.2.
- Efter 4 dagar av cellodling, ersätta mediet med 2 mL nytt medium B och överföring inverterade skålen till mikroskopet A. underhåll kulturen i en fuktad atmosfär av 10% CO2 vid 37 ° C.
5. endocytos Experiment
- Kultur mus kortikala nervceller som beskrivs i steg 1.2.
- Fyra dagar senare, ersätta mediet med 100 μL av nytt medium B innehållande 20 μM fluorescens membran probe för 1 min.
- Tillsätt 1 μL av 0,05 mM aggregerade Aβ1-42 (sista 0,5 μM) eller fordon (destillerat vatten) lösning och blanda med pipettering. Inkubera i 20 min.
- Ta bort mediet och Tvätta brunnarna två gånger med medium B som har funnits före värms till 37 ° C.
- Fixa, tvätta och montera nervceller som beskrivs i steg 1.3.3 och 1.3.4.
- Fånga lysrör och DIC bilder med en 63 X olja objektiv på inverterade mikroskopet A.
- Kvantifiera tätheten av området fluorescens membran sond-positiv i varje sund tillväxt kon med hjälp av ett bildbehandlingsprogram.
6. gen Transfection
- Förbereda kortikala nervceller som beskrivs i steg 1.2. Efter avslutad steg 1.2.1 till 1.2.10, Centrifugera nervceller vid 178 x g i 3 min.
- Ta bort supernatanten, tillsätt 4 mL Ca2 +-gratis och Mg2 +-gratis Hanks balanserad saltlösning (CMF-HBSS) och blanda genom pipettering.
- Centrifugera cellerna vid 178 x g i 3 min.
- Ta bort supernatanten, tillsätt 4 mL CMF-HBSS och blanda genom pipettering. Nästa, beräkna cell densiteten, som beskrivs i steg 1.2.10.
- Överföra 5 x 106 celler i en 1,5 mL rör och centrifugera vid 1 677 x g i 1 min.
- Ta bort supernatanten, tillsätt 100 μL av transfection lösning med tillägg och 3 μg av DNA plasmid kodning andra eller andra-AP180 C-terminus och blanda genom pipettering.
- Överför lösningen ovan (steg 6,6) till en certifierad kyvetten och transfect med en electroporator, enligt tillverkarens protokollet.
- Omedelbart efter transfection, tillsätt 500 μL av medium A in i kyvetten och överför lösningen till en 1,5-mL tub med en certifierad pipett. Nästa, beräkna cell densiteten, som beskrivs i steg 1.2.10.
- Odla cellerna i en 8-väl kultur bild på 0,8 x 104 celler per brunn, som beskrivs i steg 1.2.11 och 1.2.12.
- Efter 4 dagar av cellodling, utför en kollaps-analysen som beskrivs i steg 1.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta protokoll, var Aβ1-42 inkuberas vid 37 ° C i 7 dagar före användning, eftersom inkubering av Aβ1-42 behövdes för att producera giftiga former27,28,30,35. Efter denna inkubation observerades aggregerade former av Aβ (figur 1A). Det har rapporterats att liknande inkubering av Aβ1-42 producerade fibrill form av Aβ36. Efter behandling med denna aggregerade Aβ1-42, immunfärgning med en antikropp för den toxiska oligomerer av Aβ35,37 utfördes, och positiv färgning upptäcktes på odlade nervceller (figur 1B). Med tanke på ovanstående producerar denna inkubation protokollet de giftiga formerna av Aβ.
Flera dagar krävdes för induktion av axonal degeneration efter Aβ exponering. Händelserna före axonal degeneration förblir oklart. Detta protokoll har därför utvecklats för att ytterligare förstå mekanismerna som är involverade. Användning av detta protokoll, analyserades de tidiga fenomen som induceras av Aβ behandling. Kortikala nervceller odlades i 4 dagar. De längsta neuriter i odlade nervceller identifierades som axoner; Detta bekräftades av positiv immunfärgning för axonal markör, tau-1 och negativa immunfärgning för dendritiska markören, MAP2 (figur 2). Efter 1 h fordon behandling, hade tillväxt kottar sprida lamellipodia och bearbetas flera filopodia. Dessa identifierades som sund tillväxt kottar. Omvänt, 1 h av Aβ1-42 behandling ledde till krympta tillväxt kottar, som framkallade inga lamellipodia eller filopodia. Dessa identifierades som kollapsade tillväxt kottar. Kollaps score beräknades enligt steg 1.3.7. När former av tillväxt kottar var oklart, var de elimineras från analysen. Aβ1-42 behandling ledde till en betydande ökning av kollaps poäng, motsvarar ökade axonal tillväxt kollaps, jämfört med kollaps poängen för fordon-behandlade tillväxt kottar27.
Axonal tillväxt kottar observerades före och efter behandling med Aβ1-42 (figur 3). Celler bibehölls det inverterade mikroskopet med en fuktad atmosfär av 10% CO2 vid 37 ° C. Bilder fångades varje 5 min. I figur 3visas kollapsade tillväxt kottar mellan 21 och 26 min efter Aβ1-42 behandling. Tillväxt kottar uteslöts från levande cell imaging om de inte behålla sin friska form för 1 h innan någon behandling.
För att visualisera de tidiga effekterna av Aβ1-42-behandling, användes endocytos som fokus för denna analys, eftersom endocytos hämmare kan blockera Aβ1-42-inducerad tillväxt-cone kollaps27. Endocytos var visualiserat med en fluorescens membran sond (i.e., ett fluorescerande färgämne som binder till plasma membran och är spontant endocytosed). En tidigare studie visade att tillväxten kottar inte kollapsar på 20 min efter Aβ1-42-behandling27; därför valdes sund tillväxt kottar av DIC imaging i fordonet eller Aβ1-42-behandlade celler efter 20 min. Efter Aβ1-42-behandling observerades talrika fluorescerande membran sond-positiv puncta i tillväxt konen (figur 4). Tätheten av fluorescens membran sond-positiv puncta i tillväxt kottar var signifikant ökad27. Detta tyder på att Aβ1-42-inducerad tillväxt kon endocytos inträffar före kollapsen.
För att bekräfta rollen av endocytos, var en DNA plasmid kodning andra-AP180 C-terminus transfekterade i odlade kortikala nervceller. Celler som uttrycker AP180 C-terminus selektivt hämmade clathrin-medierad endocytos38,39. Om andra uttryck observerades vid cellkroppen i neuron, ansågs AP180 C-terminus uttryckas på axonal tillväxt konen av neuron. Transfection AP180 C-terminus blockerade Aβ1-42-inducerad tillväxt kon kollaps (figur 5)27.
Figur 1 : Inkubering av A Β1-42 aggregat Aβ. (A) Aβ1-42 var upplöst i destillerat vatten vid en koncentration av 0,5 mM och inkuberas vid 37 ° C i 7 dagar (efter inkubation), eller lagras vid-30 ° C utan inkubation (ingen inkubation). Varje Aβ lösning var utspädd till 0,1 mM; sedan var 10 μL av varje utspädda lösningen tappade på glasskivor och täckt med coverslips. Bright-fältet bilder med sned belysning fångades med inverterade mikroskopet B. skala bar = 20 μm. (B) aggregerade Aβ1-42 eller fordonet behandling på odlade nervceller i 4 h. Efter behandling, nervceller har åtgärdats och immunostained för giftiga Aβ oligomerer. Fluorescens bilder (röd) och ljusa fält bilder med sned belysning (grå) visas. Skalstapeln = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : A Β1-42-inducerad axonal tillväxt kon kollaps. Efter Aβ1-42 - eller fordon-behandling, nervceller var fast och immunostained för tau-1 (röd) och mikrotubuli associerade protein 2 (MAP2, grön). Fluorescens och differential störningar bilder med kontrast (DIC) visas. Förstorade vyer av intresse (ROI, rektanglar) regioner nedan deras motsvarande bilder. Vit skala barer = 50 μm. svart skala barer = 10 μm. Denna siffra har ändrats från Kuboyama et al, 201527. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Live cell imaging före och efter Β1-42 behandling. Efter 4 dagar av kultur, celler överfördes till ett inverterat Mikroskop och DIC bilder fångades varje 5 min. Time-lapse bilder visas. Siffrorna representerar minuter: sekunder efter tillämpningen av aggregerade Aβ1-42 (slutlig koncentration, 0,5 μM). Skalstapeln = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Tjugo minuter av A Β1-42 behandling inducerad endocytos. Kortikala nervceller var odlade i 4 dagar och behandlas med en sond med fluorescens i membranet. Sedan behandlades nervceller i 20 min med Aβ1-42 eller fordon. Fluorescens bilder av tillväxt kottarna visas. De gula streckade linjerna representerar konturerna av tillväxt kottar. Skalstapeln = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Uttryck för AP180-C terminus blockerar Aβ1-42-inducerad kollaps. Fyra dagar efter transfection av andra (A, B) eller andra-AP180 C-terminus (C, D); Aβ1-42 (B, D) eller fordon (A, C) lades till kortikala nervceller för 1 h. DIC (övre paneler) och fluorescens (bottenpaneler) bilder visas. Pilar indikerar tillväxt kottar. Skala barer = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet beskrivs i denna studie aktiverat observationen av tidig fenomen i axonal tillväxt koner efter Aβ1-42 behandling. Aβ1-42 inducerad endocytos i axonal tillväxt kottar inom 20 min och tillväxt kon kollaps observerades inom 1 h av behandling. Detta endocytos var troligen medierad av clathrin. Med hjälp av detta protokoll, bekräftades hämning av clathrin-medierad endocytos för att förhindra Aβ1-42-inducerad tillväxt kon kollaps och axonal degeneration i odlade nervceller27. Dessutom försvagade hämning av clathrin-medierad endocytos Aβ1-42-inducerad axonal degeneration och minne underskott i vivo27. Dessa resultat indikerar att clathrin-medierad endocytos är en lovande terapeutisk avenue för AD förebyggande.
Detta protokoll utvecklades från kollaps analyser för axonal tillväxt avskräckningsmedel, såsom semaphorin 3A och efrinreceptorkinaser-A516,17,18,19,20. Kollaps-analyser har använts i studier att bedöma utvecklingen av neuronala nätverk. Jag har visat att detta protokoll kan tillämpas på patologiska analyser, särskilt de som rör mekanismer av AD; en begränsning kan dock att cirka 40% av tillväxten kottar kollapsade i felfritt tillstånd. Denna procentsats är högre än resultaten från odlade dorsalrotsganglier ganglion nervceller, som är mer allmänt används i kollaps analyser16,17,18,19,20. Skillnaden i celltyper kan därför vara kopplade till skillnader i kollaps nyckeltal. Kollaps nyckeltalen fann i denna studie överensstämde med de som finns i tidigare studier med normala odlade kortikala nervceller40,41. Dessutom induceras Aβ1-42 liknande nivåer av tillväxt kon kollaps jämfört med andra kollaps faktorer, såsom semaphorin 3A och efrinreceptorkinaser-A527. Detta protokoll är därför giltig för kvantifiering av Aβ1-42-inducerad tillväxt kon kollaps. Detta fixering protokoll är viktigt att bibehålla formen av tillväxt kottar. Om cellerna var konventionellt fast med 4% PARAFORMALDEHYD i rumstemperatur, kan mer tillväxt kottar har kollapsat på grund av förfarandet för fixering (inga data anges). Alternativt, glutaraldehyd och fixering buffertar är tillgängliga för stel fixering, som tidigare beskrivits42; dock uppvisar glutaraldehyd autofluorescens, som är ett betydande hinder för fluorescens imaging.
En färsk studie med samma protokoll visade att vatten extraktet från Radix Polygalae (rötter av Polygala tenuifolia) inhiberad Aβ1-42-inducerad endocytos i odlade nervceller, förhindrade axonal degeneration och nedsatt minne underskott i en transgen musmodell av AD31. En ny kandidat för AD förebyggande har hittats med detta protokoll. En kombination av genen transfection och levande cell imaging i detta protokoll kan visa andra cellulära händelser Funna i axoner och deras terminaler före och efter Aβ behandling, såsom Ca2 + imaging, mikrotubuli dynamics och cell adhesion dynamik, som är enligt uppgift relaterade till axonal tillväxt43,44,45. Detta protokoll kan hjälpa avslöja mer detaljerad mekanismer av Aβ toxicitet och kan hjälpa till att leda av förebyggande eller behandling av AD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete var delvis stöds av forskningsanslag från JSPS (KAKENHI 18K 07389), Japan, Takeda Science Foundation, Japan och Kobayashi Pharmaceutical Co., Ltd., Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ddY mice | SLC | ||
| Eight-well culture slide | Falcon | 354108 | |
| poly D lysine | Wako | 168-19041 | |
| Culture medium, Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| house serum | Gibco | 26050-088 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| L-glutamine | Wako | 074-00522 | |
| 0.05% trypsin | Gibco | 25300-054 | |
| DNase I | Worthington | DP | |
| soybean trypsin inhibitor | Gibco | 17075-029 | |
| Filter with 70 µm mesh size, cell strainer | Falcon | 352350 | |
| B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| CO2 incubator | Astec | SCA-165DS | |
| Amyloid β1-42 | Sigma-Aldrich | A9810 | |
| paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| sucrose | Wako | 196-00015 | |
| Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount | polysciences | 18606-20 | |
| Inverted microscope A | Carl Zeiss | Axio Observer Z1 | Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1 |
| Objective Plan-Apochromat 20x | Carl Zeiss | 420650-9901 | |
| Objective Plan-Apochromat 63x | Carl Zeiss | 440762-9904 | |
| Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X | Nikon | ||
| anti-MAP2 IgG | Abcam | ab32454 | |
| anti-tau-1 IgG | Chemicon | MAB3420 | |
| anti-amyloid β antibody | IBL | 10379 | clone 11A1 |
| normal goat serum | Wako | 143-06561 | |
| bovine serum albumin | Wako | 010-25783 | |
| t-octylphenoxypolyethoxyethanol | Wako | 169-21105 | |
| goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594 | Invitrogen | A11032 | |
| goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| hot plate | NISSIN | NHP-M30N | |
| cover glass | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| 35 mm dish | IWAKI | 1000-035 | |
| Silicone RTV | Shin-Etsu | KE42T | |
| hand punch | Roper Whitney | No. XX | |
| Fluorescence membrane probe, FM1-43FX | Invitrogen | F35355 | |
| Ca2+- and Mg2+-free Hanks' balanced salt solution | Gibco | 14175-095 | |
| Transfection solution, Nucleofector solution | Lonza | VPG-1001 | |
| Electroporator, Nucleofector I | Amaxa | ||
| Inverted microscope B | Keyence | BZ-X710 | |
| Image software, ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8 (6), 595-608 (2016).
- Dickson, T. C., Vickers, J. C. The morphological phenotype of beta-amyloid plaques and associated neuritic changes in Alzheimer's disease. Neuroscience. 105 (1), 99-107 (2001).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
- Perl, D. P.
- Graham, W. V., Bonito-Oliva, A., Sakmar, T. P. Update on Alzheimer's Disease Therapy and Prevention Strategies. Annual Review of Medicine. 68, 413-430 (2017).
- Jack, C. R. Jr, et al. Hypothetical model of dynamic biomarkers of the Alzheimer's pathological cascade. Lancet Neurology. 9 (1), 119-128 (2010).
- Kuboyama, T., Tohda, C., Komatsu, K. Neuritic regeneration and synaptic reconstruction induced by withanolide A. British Journal of Pharmacology. 144 (7), 961-971 (2005).
- Tohda, C., Urano, T., Umezaki, M., Nemere, I., Kuboyama, T. Diosgenin is an exogenous activator of 1,25D3-MARRS/Pdia3/ERp57 and improves Alzheimer's disease pathologies in 5XFAD mice. Scientific Reports. 2, 535 (2012).
- Jawhar, S., Trawicka, A., Jenneckens, C., Bayer, T. A., Wirths, O. Motor deficits, neuron loss, and reduced anxiety coinciding with axonal degeneration and intraneuronal Abeta aggregation in the 5XFAD mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging. 33 (1), e129-e140 (2012).
- Postuma, R. B., et al. Substrate-bound beta-amyloid peptides inhibit cell adhesion and neurite outgrowth in primary neuronal cultures. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1122-1130 (2000).
- Tohda, C., Nakada, R., Urano, T., Okonogi, A., Kuboyama, T. Kamikihi-to (KKT) rescues axonal and synaptic degeneration associated with memory impairment in a mouse model of Alzheimer's disease, 5XFAD. International Journal of Neuroscience. 121 (12), 641-648 (2011).
- Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nature Neuroscience. 7 (11), 1181-1183 (2004).
- Wirths, O., Weis, J., Kayed, R., Saido, T. C., Bayer, T. A. Age-dependent axonal degeneration in an Alzheimer mouse model. Neurobiology of Aging. 28 (11), 1689-1699 (2007).
- Sanchez-Varo, R., et al. Abnormal accumulation of autophagic vesicles correlates with axonal and synaptic pathology in young Alzheimer's mice hippocampus. Acta Neuropathologica. 123 (1), 53-70 (2012).
- Wu, H. Y., et al. Amyloid beta induces the morphological neurodegenerative triad of spine loss, dendritic simplification, and neuritic dystrophies through calcineurin activation. Journal of Neuroscience. 30 (7), 2636-2649 (2010).
- Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32 (6), 1013-1026 (2001).
- Jurney, W. M., Gallo, G., Letourneau, P. C., McLoon, S. C. Rac1-mediated endocytosis during ephrin-A2- and semaphorin 3A-induced growth cone collapse. Journal of Neuroscience. 22 (14), 6019-6028 (2002).
- Luo, Y., Raible, D., Raper, J. A. Collapsin: a protein in brain that induces the collapse and paralysis of neuronal growth cones. Cell. 75 (2), 217-227 (1993).
- Nicol, X., Muzerelle, A., Rio, J. P., Metin, C., Gaspar, P. Requirement of adenylate cyclase 1 for the ephrin-A5-dependent retraction of exuberant retinal axons. Journal of Neuroscience. 26 (3), 862-872 (2006).
- Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436 (7053), 1020-1024 (2005).
- Benes, F. M., Farol, P. A., Majocha, R. E., Marotta, C. A., Bird, E. D. Evidence for axonal loss in regions occupied by senile plaques in Alzheimer cortex. Neuroscience. 42 (3), 651-660 (1991).
- Masliah, E., et al. An antibody against phosphorylated neurofilaments identifies a subset of damaged association axons in Alzheimer's disease. American Journal of Pathology. 142 (3), 871-882 (1993).
- Zhou, F. Q., Snider, W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 361 (1473), 1575-1592 (2006).
- Teshigawara, K., et al. A novel compound, denosomin, ameliorates spinal cord injury via axonal growth associated with astrocyte-secreted vimentin. British Journal of Pharmacology. 168 (4), 903-919 (2013).
- Kuboyama, T., Tohda, C., Komatsu, K. Withanoside IV and its active metabolite, sominone, attenuate A beta(25-35)-induced neurodegeneration. European Journal of Neuroscience. 23 (6), 1417-1426 (2006).
- Tanabe, N., Kuboyama, T., Tohda, C. Matrine Directly Activates Extracellular Heat Shock Protein 90, Resulting in Axonal Growth and Functional Recovery in Spinal Cord Injured-Mice. Frontiers in Pharmacology. 9 (446), (2018).
- Kuboyama, T., Lee, Y. A., Nishiko, H., Tohda, C. Inhibition of clathrin-mediated endocytosis prevents amyloid beta-induced axonal damage. Neurobiology of Aging. 36 (5), 1808-1819 (2015).
- Pike, C. J., Walencewicz, A. J., Glabe, C. G., Cotman, C. W. In vitro aging of beta-amyloid protein causes peptide aggregation and neurotoxicity. Brain Research. 563 (1-2), 311-314 (1991).
- Uchida, N., et al. Yokukansan inhibits social isolation-induced aggression and methamphetamine-induced hyperlocomotion in rodents. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 32 (3), 372-375 (2009).
- Pike, C. J., Burdick, D., Walencewicz, A. J., Glabe, C. G., Cotman, C. W. Neurodegeneration induced by beta-amyloid peptides in vitro: the role of peptide assembly state. Journal of Neuroscience. 13 (4), 1676-1687 (1993).
- Kuboyama, T., Hirotsu, K., Arai, T., Yamasaki, H., Tohda, C. Polygalae Radix Extract Prevents Axonal Degeneration and Memory Deficits in a Transgenic Mouse Model of Alzheimer's Disease. Frontiers in Pharmacology. 8, 805 (2017).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Arimura, N., Kaibuchi, K. Neuronal polarity: from extracellular signals to intracellular mechanisms. Nature Reviews: Neuroscience. 8 (3), 194-205 (2007).
- De Felice, F. G., et al. Alzheimer's disease-type neuronal tau hyperphosphorylation induced by A beta oligomers. Neurobiology of Aging. 29 (9), 1334-1347 (2008).
- Izuo, N., et al. Toxicity in Rat Primary Neurons through the Cellular Oxidative Stress Induced by the Turn Formation at Positions 22 and 23 of Aβ42. ACS Chemical Neuroscience. 3 (9), 674-681 (2012).
- Fujiwara, H., et al. Uncaria rhynchophylla, a Chinese medicinal herb, has potent antiaggregation effects on Alzheimer's beta-amyloid proteins. Journal of Neuroscience Research. 84 (2), 427-433 (2006).
- Murakami, K., et al. Monoclonal antibody against the turn of the 42-residue amyloid beta-protein at positions 22 and 23. ACS Chemical Neuroscience. 1 (11), 747-756 (2010).
- Ford, M. G., et al. Simultaneous binding of PtdIns(4,5)P2 and clathrin by AP180 in the nucleation of clathrin lattices on membranes. Science. 291 (5506), 1051-1055 (2001).
- Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66 (3), 370-377 (2010).
- Ahmed, G., et al. Draxin inhibits axonal outgrowth through the netrin receptor DCC. Journal of Neuroscience. 31 (39), 14018-14023 (2011).
- Brennaman, L. H., Moss, M. L., Maness, P. F. EphrinA/EphA-induced ectodomain shedding of neural cell adhesion molecule regulates growth cone repulsion through ADAM10 metalloprotease. Journal of Neurochemistry. 128 (2), 267-279 (2014).
- Tojima, T., et al. Attractive axon guidance involves asymmetric membrane transport and exocytosis in the growth cone. Nature Neuroscience. 10 (1), 58-66 (2007).
- Ooashi, N., Futatsugi, A., Yoshihara, F., Mikoshiba, K., Kamiguchi, H. Cell adhesion molecules regulate Ca2+-mediated steering of growth cones via cyclic AMP and ryanodine receptor type 3. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1159-1167 (2005).
- Biswas, S., Kalil, K. The Microtubule-Associated Protein Tau Mediates the Organization of Microtubules and Their Dynamic Exploration of Actin-Rich Lamellipodia and Filopodia of Cortical Growth Cones. Journal of Neuroscience. 38 (2), 291-307 (2018).
- Kuboyama, T., et al. Paxillin phosphorylation counteracts proteoglycan-mediated inhibition of axon regeneration. Experimental Neurology. 248, 157-169 (2013).
