Visualisere Axonal vekst kjegle kollaps og tidlig Amyloid β effekter i kulturperler musen nerveceller

Summary

Her vises en protokoll for å undersøke tidlig virkningene av amyloid-β (Aβ) i hjernen. Dette viser at Aβ induserer clathrin-mediert endocytose og sammenbruddet av axonal veksten kjeglene. Protokollen er nyttig i å studere tidlig effekter av Aβ på axonal veksten kjeglene og kan lette forebygging av Alzheimers sykdom.

Abstract

Amyloid-β (Aβ) forårsaker minne impairments i Alzheimers sykdom (AD). Selv om therapeutics har vist seg å redusere Aβ nivåer i hjernen til AD pasienter, bedre dette ikke minne. Siden Aβ samler i hjernen før utseendet av minne impairments, kan målretting Aβ være ineffektivt for behandling av AD pasienter som allerede viser minne underskudd. Derfor bør nedstrøms signalisering på grunn av Aβ avsettelse blokkeres før Annonsen utvikling. Aβ induserer axonal degenerasjon, fører til avbrudd i nevrale nettverk og minne impairments. Selv om det er mange studier på mekanismer for Aβ toksisitet, fortsatt kilden til Aβ toksisitet ukjent. For å identifisere kilden, foreslår vi en ny protokoll som bruker mikroskopi, gene transfection og levende celle for å undersøke tidlig endringer forårsaket av Aβ i axonal veksten kjeglene kulturperler neurons. Denne protokollen avslørte at Aβ indusert clathrin-mediert endocytose i axonal veksten kjeglene etterfulgt av vekst kjegle kollaps, demonstrere at hemming av endocytose hindrer Aβ toksisitet. Denne protokollen vil være nyttig i å studere tidlig effekten av Aβ og kan føre til mer effektiv og forebyggende AD behandling.

Introduction

Amyloid-β (Aβ) innskudd finnes i hjernen av pasienter med Alzheimers sykdom (AD) og regnes som en viktig årsak til AD¹ som forstyrrer nevrale nettverk, fører til minne impairments^2,3,4. Mange klinisk narkotika kandidater har vist seg å effektivt hindre amyloid-β (Aβ) produksjon eller fjerne Aβ innskudd. Men har ingen klart å forbedre minnefunksjon i AD pasienter⁵. Aβ er allerede deponert i hjernen før utbruddet av minne impairments⁶; Derfor kan redusere Aβ nivåer i hjernen til pasienter stiller minne impairments være ineffektivt. Aβ avsettelse finnes i preklinisk AD pasienter; men presenterer disse pasientene sjelden neuronal degenerasjon og minne underskudd⁶. Det er en tidsforsinkelse mellom Aβ avsettelse og minne impairments. Derfor blokkerer en viktig strategi for forebygging av AD Aβ toksisitet signalering i den tidlige fasen av Annonsen, før utviklingen av minne underskudd. Aβ avsettelse induserer axon degenerasjon^{7,8,9,10,11,12,13}, som kan føre til en forstyrrelse av nevrale nettverk og permanent nedskrivninger av minnefunksjon. Mange studier har undersøkt virkningsmekanismer Aβ toksisitet; for eksempel har degenerert axons AD mus hjerner blitt vist å ha økt autophagy¹⁴. Calcineurin aktivisering har blitt rapportert som en mulig mekanisme Aβ-indusert axonal degenerasjon¹⁵; imidlertid fortsatt direkte avtrekkeren axonal degenerasjon ukjent.

Denne studien fokuserer på sammenbruddet av axonal avslutninger kalt veksten kjeglene. Sammenbruddet av axonal veksten kjeglene kan skyldes axonal vekst repellents, som semaphorin 3A og ephrin-A5^{16,17,18,19,20}. Skjul-lignende dystrophic axonal avslutninger er observert i hjernen til AD pasienter^21,22. I tillegg kan en svikt i vekst kjegle fungerer provosere axonal degenerasjon²³. Men er det ukjent om Aβ induserer vekst kjegle kollaps. Derfor presenterer denne studien en ny protokoll å observere tidlig effekten av Aβ i kulturperler nevroner og undersøke Aβ-indusert vekst kjegle kollaps.

Protocol

Alle eksperimentene ble utført i henhold til veiledning og bruk av forsøksdyr på Sugitani Campus av University of Toyama og ble godkjent av komiteen for Animal Care og bruk av forsøksdyr på Sugitani Campus av den University of Toyama (A2014INM-1, A2017INM-1). 1. kollaps analysen Poly-D-lysine belegg Coat 8-brønnen lysbilder med 400 μL 5 μg/mL poly-D-lysine (PDL) i fosfat-bufret saltvann (PBS) og ruge dem på 37 ° C over natten. Fjerne PDL løsningen og vas…

Representative Results

I denne protokollen, ble Aβ1-42 inkubert på 37 ° C i 7 dager før bruk fordi inkubasjonstiden for Aβ1-42 var nødvendig for å produsere toksiske formene27,28,30,35. Etter denne inkubasjon ble aggregert former for Aβ observert (figur 1A). Det har blitt rapportert at lignende inkubasjonstiden for Aβ1-42 produsert fibril form av…

Discussion

Protokollen beskrevet i denne studien aktivert observasjon av tidlig fenomener i axonal veksten kjeglene etter Aβ1-42 behandling. Aβ1-42 indusert endocytose i axonal veksten kjeglene innen 20 min, og vekst kjegle kollaps ble observert i 1t behandling. Denne endocytose var sannsynligvis formidlet av clathrin. Bruker denne protokollen, ble hemming av clathrin-mediert endocytose bekreftet for å hindre Aβ1-42-indusert vekst kjegle kollaps og axonal degenerasjon i kulturperler neurons²⁷. I tillegg …

Materials

ddY mice	SLC
Eight-well culture slide	Falcon	354108
poly D lysine	Wako	168-19041
Culture medium, Neurobasal medium	Gibco	21103-049
house serum	Gibco	26050-088
glucose	Wako	049-31165
L-glutamine	Wako	074-00522
0.05% trypsin	Gibco	25300-054
DNase I	Worthington	DP
soybean trypsin inhibitor	Gibco	17075-029
Filter with 70 µm mesh size, cell strainer	Falcon	352350
B-27 supplement	Gibco	17504-044
CO2 incubator	Astec	SCA-165DS
Amyloid β1-42	Sigma-Aldrich	A9810
paraformaldehyde	Wako	162-16065
sucrose	Wako	196-00015
Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount	polysciences	18606-20
Inverted microscope A	Carl Zeiss	Axio Observer Z1	Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1
Objective Plan-Apochromat 20x	Carl Zeiss	420650-9901
Objective Plan-Apochromat 63x	Carl Zeiss	440762-9904
Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X	Nikon
anti-MAP2 IgG	Abcam	ab32454
anti-tau-1 IgG	Chemicon	MAB3420
anti-amyloid β antibody	IBL	10379	clone 11A1
normal goat serum	Wako	143-06561
bovine serum albumin	Wako	010-25783
t-octylphenoxypolyethoxyethanol	Wako	169-21105
goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594	Invitrogen	A11032
goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488	Invitrogen	A11029
hot plate	NISSIN	NHP-M30N
cover glass	Fisher Scientific	12-545-85
35 mm dish	IWAKI	1000-035
Silicone RTV	Shin-Etsu	KE42T
hand punch	Roper Whitney	No. XX
Fluorescence membrane probe, FM1-43FX	Invitrogen	F35355
Ca2+– and Mg2+-free Hanks' balanced salt solution	Gibco	14175-095
Transfection solution, Nucleofector solution	Lonza	VPG-1001
Electroporator, Nucleofector I	Amaxa
Inverted microscope B	Keyence	BZ-X710
Image software, ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/