Generación de células NK humano primario y ampliado de Knock-out utilizando ribonucleoproteínas Cas9
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para modificar genéticamente las células primarias o ampliadas humano naturales del asesino (NK) usando Cas9 ribonucleoproteínas (Cas9/RNPs). Mediante este protocolo, hemos generado las células NK humanas deficientes para el receptor 2 del factor de crecimiento-b de transformación (TGFBR2) y la hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 (HPRT1).
Abstract
CRISPR/Cas9 tecnología está acelerando ingeniería del genoma en muchos tipos celulares, pero hasta el momento, genes y modificación genética estable han sido difíciles en primarias células de NK. Por ejemplo, entrega de transgenes mediante transducción retroviral o lentivirales dio lugar a una producción limitada de ingeniería genética de las células NK por sustancial asociada a procedimiento NK apoptosis de las células. Aquí describimos un método libre de ADN para la edición del genoma de humanos primarias y ampliadas las células NK mediante complejos de ribonucleoproteína Cas9 (Cas9/RNPs). Este método permite eficiente nocaut del TGFBR2 y HPRT1 genes en las células NK. Datos de RT-PCR demostraron una disminución significativa en el nivel de expresión del gen, y un ensayo de citotoxicidad de un producto representativo de la célula sugiere que las células NK modificado de RNP se hizo menos sensibles a TGFβ. Células genéticamente modificadas podrían ser ampliada post-electroporación por estimulación con mbIL21-expresando irradiado células de alimentador.
Introduction
Inmunoterapia de cáncer se ha avanzado en los últimos años. Las células T antígeno quimérico genéticamente del receptor (coche) son un excelente ejemplo de ingeniería células inmunes desplegado en inmunoterapia del cáncer. Estas células fueron recientemente aprobadas por la FDA para el tratamiento contra CD19 + B de células malignas, pero éxito hasta el momento se ha limitado a enfermedades teniendo unos antígenos targetable y dirigidas a tal limitado repertorio antigénico son propensa al fracaso por escape inmune. Además, las células de T del coche se han enfocado en el uso de células de T autólogas debido al riesgo de enfermedad injerto contra – host causado por células T trasplante allogeneic. En contraste, las células NK son capaces de matar a objetivos de tumor de manera independiente del antígeno y no causan Eich, que hace un buen candidato para cáncer inmunoterapia6,7,8,9.
CRISPR/Cas9 tecnología ha sido utilizada recientemente en células inmunes ingeniería y reprogramar genéticamente las células NK con los plásmidos ha sido siempre un reto. Esto ha sido debido a las dificultades en la entrega del transgen de una manera dependiente de ADN como transducción retroviral y lentivirales causando sustancial asociada a procedimiento NK apoptosis de las células y la producción limitada de ingeniería genética de las células NK4 , 9.
Muchas células inmunes innatas expresan altos niveles de receptores para patrones moleculares asociados a patógenos como gen inducible por ácido retinoico me (RIG-I), que permiten una mayor reconocimiento de ADN extraño. Supresión de estas vías ha permitido una mayor eficiencia de transducción en las células NK al utilizar métodos basados en DNA para la modificación genética10.
Aquí describimos el método para el uso de un genoma de ADN libre edición de primarias y expansión humana las células NK utilizando complejos de ribonucleoproteína Cas9 (Cas9/RNPs). Cas9/RNPs se compone de tres componentes, recombinante proteína Cas9 complexed con sintético RNA solo guía conformada por un complejo crRNA y tracerRNA. Estos Cas9/RNPs son capaces de unirse genómicas objetivos con mayor eficiencia en comparación con los enfoques de ADN-dependiente extranjeras debido a su entrega como complejos funcionales. Además, separación rápida de Cas9/RNPs de las células puede reducir los efectos off-target como inducción de la apoptosis. Por lo tanto, puede utilizarse para generar knock-out o knock-ins cuando se combina con el ADN por recombinación homóloga6,7. Demostramos que la electroporación de Cas9/RNPs es un método fácil y relativamente eficiente que supera las limitaciones anteriores de modificación genética en las células NK.
TGFβ es una citocina inmunosupresora importante, que inhibe la activación y funciones de las células NK. Se ha sugerido que dirigidas a la vía TGFβ pueden aumentar las funciones inmunes celulares. Hemos dirigido la región codificación ectodominio TGBR2 que une TGFβ11. Resultados representativos muestran una disminución significativa en el nivel de expresión del mRNA de este gen y además demuestran que las células NK modificadas volverse resistentes a los TGFβ. Además, las células modificadas retienen la viabilidad y potencial proliferativo, son capaces de ser post-electroporación ampliada utilizando células de alimentador irradiados. Por lo tanto, el método siguiente es un enfoque prometedor para manipular genéticamente las células de NK para cualquiera más clínico o con fines de investigación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modificación de ADN-dependiente de las células NK ha sido desafiante4,9. Nosotros, por lo tanto, introduce directamente un complejo de ribonucleoproteína sintéticamente preformado (RNPs) y proteína Cas9 como purificado de la proteína primaria y ampliado de las células NK8. Este método nos permitió eliminar el recubrimiento de jales, y otros procesos transcripcionales y traduccional Iniciado por ARN polimerasa II, que puede causar …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos Brian Tullius para su ayuda en editar el manuscrito.
Materials
| RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15065 | The RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection. |
| Ficoll-Paque® PLUS | GE Healthcare – Life Sciences | 17-1440-02 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072532 | TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA | Integrated DNA Technologies | Synthetically produced as Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest | |
| Alt-R® Genome Editing Detection Kit | Integrated DNA Technologies | 1075931 | Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls. |
| Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304-011 | |
| 4D-Nucleofector™ System | Lonza | AAF-1002B | |
| Human recombinant IL-2 Protein | Novartis | 65483-0116-07 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit | Lonza | V4XP-3032 | Contains pmaxGFP™ Vector, Nucleofector™ Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette™ Strips |
| Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus | Dharmacon | CTM-360019 | |
| Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1074181 | Cas9 Nuclease |
| DNeasy® Blood & Tissue Handbook | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | |
| TGFβ | Biolegend | 580706 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Human | Integrated DNA Technologies | 1072554 | Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer. |
| IDTE pH 7.5 (1X TE Solution) | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
| Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | Cas9 Electroporation Enhancer |
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