Cas9 Ribonucleoproteins kullanarak Knock-out birincil ve genişletilmiş insan NK hücre üretimi
Summary
Burada, genetik olarak Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs) kullanarak birincil veya genişletilmiş insan doğal öldürücü (NK) hücreleri değiştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralını kullanarak, biz insan NK hücreleri dönüştürme büyüme faktörü-b reseptör 2 (TGFBR2) ve hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) için eksik oluşturulan.
Abstract
CRISPR/Cas9 teknoloji genom mühendislik birçok hücre tipleri, ama şimdiye kadar gen teslim hızlanıyor ve istikrarlı gen değişikliği birincil NK hücreleri zorlu olmuştur. Örneğin, lentiviral veya retroviral iletim kullanarak transgene teslim hücrelerinin genetik mühendisliğiyle NK önemli yordamı ilişkili NK hücre apoptosis nedeniyle sınırlı bir verim sonuçlandı. Biz burada genom Cas9 Ribonükleoprotein kompleksleri (Cas9/RNPs) kullanarak insan birincil ve genişletilmiş NK hücreleri düzenleme için bir DNA ücretsiz yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem etkili nakavt TGFBR2 ve NK hücreleri HPRT1 genlerinde izin. Veri RT-PCR gen ifade düzey önemli bir azalma gösterdi ve sitotoksisite tahlil bir temsilcisi hücre ürünün RNP-modified NK hücreleri TGFβ için daha az duyarlı oldu önerdi. Genetiği değiştirilmiş hücreler stimülasyon ile ışınlanmış mbIL21 ifade tarafından Genişletilmiş yazı Elektroporasyon olabilir besleyici hücreler.
Introduction
Kanserli hastalarda son yıllarda ilerlemiştir. Genetik olarak değiştirilmiş chimeric antijen reseptör (araba) T hücreleri mühendislik bağışıklık hücrelerinin kanserli hastalarda başarıyla dağıtmış mükemmel bir örnektir. Bu hücreler son zamanlarda karşı tedavi için FDA tarafından onaylanmış CD19 + B hücre maligniteler, ama başarı defa birkaç targetable antijenleri taşıyan hastalıklar için sınırlı olmuştur ve böyle sınırlı antijenik kapsayacağını hedefliyor bağışıklık kaçış başarısızlık eğilimli. Ayrıca, araba T hücre otolog T hücreleri kullanımı Greft – versus – host hastalığı allojeneik T hücreleri tarafından neden riski nedeniyle odaklanmıştır. Buna ek olarak, NK hücreleri tümör hedefleri bir antijen-bağımsız şekilde öldürmek edebiliyoruz ve onları kanser immünoterapi6,7,8,9için iyi bir aday yapar GvHD neden olmaz.
CRISPR/Cas9 teknoloji son zamanlarda mühendislik bağışıklık hücreleri kullanılmaktadır ama genetik olarak NK hücreleri Plasmid’ler ile yeniden programlama her zaman zor olmuştur. Bu önemli yordamı ilişkili NK hücre apoptozis ve sınırlı üretim genetiği NK hücreleri4 neden lentiviral ve retroviral iletim gibi bir DNA bağımlı şekilde transgene teslim zorluklar nedeniyle oldu , 9.
Birçok doğuştan gelen bağışıklık hücreleri reseptörleri patojen ilişkili moleküler modelleri için yüksek düzeyde gibi hızlı retinoik asit-indüklenebilir gene ben (teçhizat-ben), hangi yabancı DNA’ın artan tanıma etkinleştirmek. Bu yollar bastırılması daha yüksek iletim verimliliği NK hücrelerindeki DNA tabanlı yöntemleri için genetik değişiklik10kullanırken sağlamıştır.
Biz burada bir DNA ücretsiz genom Cas9 Ribonükleoprotein kompleksleri (Cas9/RNPs) kullanarak birincil ve genişletilmiş insan NK hücreleri düzenleme kullanma yöntemi açıklanmaktadır. Cas9/RNPs, üç bileşenden, Rekombinant protein Cas9 bir complexed crRNA ve tracerRNA oluşan sentetik tek-Kılavuzu RNA ile complexed oluşur. Bu Cas9/RNPs fonksiyonel kompleksler olarak onların teslim nedeniyle yabancı DNA-bağımlısı yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında daha yüksek verimlilik ile genomik hedefleri fizyon yeteneğine sahiptirler. Ayrıca, Cas9/RNPs hücrelerden hızlı Gümrükleme gibi apoptozis indüksiyon hedef kapalı etkileri azaltabilir. Böylece, knock-bileşen Homolog rekombinasyon6,7için DNA ile kombine edildiğinde veya knock-out oluşturmak için kullanılabilir. Cas9/RNPs o Elektroporasyon gösterdik NK hücrelerindeki genetik değişiklik önceki kısıtlamaları üstesinden gelir bir kolay ve nispeten verimli yöntemidir.
TGFβ harekete geçirmek ve NK hücrelerin işlevlerini inhibe büyük bir immünsüpresif sitokin var. TGFβ yolu hedefleme bağışıklık hücre işlevlerini artırabilir sürülmüştür. Biz TGBR2 ectodomain TGFβ11. bağlayan kodlama bölge hedefli Temsilcisi sonuçları bu gen mRNA ifade düzeyini önemli bir azalma göstermek ve daha da değiştirilmiş NK hücreleri TGFβ için dayanıklı hale göstermek. Buna ek olarak, Genişletilmiş yazı Elektroporasyon radyasyonlu besleyici hücreler. kullanarak olmak mümkün olduğu gibi değiştirilmiş hücreler canlılığı ve proliferatif potansiyel, korumak Bu nedenle, aşağıdaki yöntemi NK hücreleri herhangi için genetik olarak işlemek için umut verici bir yaklaşımdır daha fazla klinik veya araştırma amaçlı.
Protocol
Representative Results
Discussion
NK hücreleri DNA-bağımlısı değişiklik4,9zor oldu. Biz, bu nedenle, doğrudan bir sentetik ön şekillendirilmesi Ribonükleoprotein (RNPs) karmaşık ve Cas9 protein saf protein birincil ve genişletilmiş NK hücreleri8içine tanıttı. Bu yöntem takip, kapatma, ortadan kaldırmak için bize izin verdi ve RNA polimeraz II, DNA-bağımlısı iletim yöntemleri ile ilişkili NK hücre apoptosis neden olabilecek diğer transkripsiyon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El yazması düzenleme tür yardım için Brian Tullius anıyoruz.
Materials
| RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15065 | The RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection. |
| Ficoll-Paque® PLUS | GE Healthcare – Life Sciences | 17-1440-02 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072532 | TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA | Integrated DNA Technologies | Synthetically produced as Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest | |
| Alt-R® Genome Editing Detection Kit | Integrated DNA Technologies | 1075931 | Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls. |
| Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304-011 | |
| 4D-Nucleofector™ System | Lonza | AAF-1002B | |
| Human recombinant IL-2 Protein | Novartis | 65483-0116-07 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit | Lonza | V4XP-3032 | Contains pmaxGFP™ Vector, Nucleofector™ Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette™ Strips |
| Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus | Dharmacon | CTM-360019 | |
| Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1074181 | Cas9 Nuclease |
| DNeasy® Blood & Tissue Handbook | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | |
| TGFβ | Biolegend | 580706 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Human | Integrated DNA Technologies | 1072554 | Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer. |
| IDTE pH 7.5 (1X TE Solution) | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
| Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | Cas9 Electroporation Enhancer |
References
- Guven, H., et al. Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction. Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).
- Alici, E., Sutlu, T., Sirac Dilber, M. Retroviral gene transfer into primary human natural killer cells. Methods in Molecular Biology. 508, 127-137 (2009).
- Carlsten, M., Childs, R. W. Genetic Manipulation of NK Cells for Cancer Immunotherapy: Techniques and Clinical Implications. Frontiers in Immunology. 6, 266 (2015).
- Mehta, R. S., Rezvani, K. Chimeric Antigen Receptor Expressing Natural Killer Cells for the Immunotherapy of Cancer. Frontiers in Immunology. 283, 9 (2018).
- Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
- Wang, M., et al. Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles. PNAS. 113 (11), 2868-2873 (2016).
- Liang, Z., et al. Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 8, 14261 (2017).
- DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein. Methods. , 9-15 (2017).
- Rezvani, K., Rouce, R., Liu, E., Shpall, E. Engineering Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy. Molecular Therapy. 25 (8), 1769-1781 (2017).
- Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Human Gene Therapy. 23 (10), 1090-1100 (2012).
- Viel, S., et al. TGF-beta inhibits the activation and functions of NK cells by repressing the mTOR pathway. Science Signaling. 9 (415), (2016).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. JoVE. (48), (2011).
- Lee, D. A., Verneris, M. R., Campana, D. Acquisition, preparation, and functional assessment of human NK cells for adoptive immunotherapy. Methods in Molecular Biology. , 61-77 (2010).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), 407-415 (2015).
- Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).
- Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Chmielecki, J., et al. Genomic Profiling of a Large Set of Diverse Pediatric Cancers Identifies Known and Novel Mutations across Tumor Spectra. Cancer Research. 77 (2), 509-519 (2017).
- Schultz, L. M., Majzner, R., Davis, K. L., Mackall, C. New developments in immunotherapy for pediatric solid tumors. Current Opinion in Pediatrics. 30 (1), 30-39 (2018).
