Geração de células NK humana primárias e expandida de Knock-out usando ribonucleoproteínas Cas9
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para modificar geneticamente as células assassinas naturais humano primário ou expandido (NK) usando Cas9 ribonucleoproteínas (Cas9/RNPs). Usando este protocolo, geramos humanas células NK deficientes para transformar o receptor 2 do fator de crescimento – b (TGFBR2) e hipoxantina Fosforibosiltransferase 1 (HPRT1).
Abstract
CRISPR/Cas9 tecnologia está acelerando a engenharia do genoma em muitos tipos de células, mas até agora, entrega do gene e modificação genética estável ter sido desafiador no primárias células NK. Por exemplo, entrega de transgene usando transdução Lentivirus ou retroviral resultou em um rendimento limitado de geneticamente modificadas as células NK devido a apoptose celular NK substancial procedimento associado. Descrevemos aqui um método livre de DNA para edição de genoma de células humanas primárias e expandidas NK usando complexos de ribonucleoprotein Cas9 (Cas9/RNPs). Este método permitiu eficiente nocaute do TGFBR2 e HPRT1 de genes em células NK. Dados de RT-PCR mostram uma diminuição significativa no nível de expressão do gene, e um ensaio de citotoxicidade de um produto representativo da célula sugeriu que as células NK RNP-modificado tornou-se menos sensíveis a TGFβ. Células geneticamente modificadas podem ser expandido post-eletroporação por estimulação com mbIL21-expressando irradiado células do alimentador.
Introduction
Imunoterapia tem sido avançada nos últimos anos. As pilhas de T do receptor (carro) de antígeno quimérico geneticamente modificados são um excelente exemplo de células do sistema imunológico engenharia implantado com sucesso em imunoterapia. Estas células foram recentemente aprovadas pelo FDA para o tratamento contra CD19 + B de células malignas, mas sucesso até agora tem sido limitado a doenças tendo alguns antígenos targetable e direcionamento de tais repertórios antigênicos limitados é propenso ao fracasso pela fuga imune. Além disso, as células T de carro foi centraram-se sobre o uso de células autólogas T devido ao risco de enxerto versus doença– host causada por pilhas de T alogênico. Em contraste, as células NK são capazes de matar alvos de tumor de forma independente de antigénio e não causam GvHD, que os torna um bom candidato para câncer imunoterapia6,7,8,9.
CRISPR/Cas9 tecnologia tem sido usada recentemente em engenharia células do sistema imune, mas geneticamente reprogramar células NK com plasmídeos sempre foi um desafio. Isto foi devido a dificuldades na entrega do transgene em uma maneira dependente de DNA como transdução de Lentivirus e retroviral causando substancial associada a procedimento NK apoptose celular e a produção limitada da engenharia genética de células NK4 , 9.
Muitas células do sistema imune inatas expressam altos níveis de receptores para padrões moleculares associados patógeno como gene induzida em ácido retinoico eu (RIG-eu), que permitem maior reconhecimento de DNA estranho. Supressão destas vias permitiu maior eficiência de transdução em células NK quando usando métodos baseados em DNA por modificação genética10.
Descrevemos aqui o método para usar um genoma DNA livre edição de primárias e expandidas NK células humanas utilizando complexos de ribonucleoprotein Cas9 (Cas9/RNPs). Cas9/RNPs é composto de três componentes, recombinante Cas9 proteína complexada com RNA de single-guia sintético composto de um complexado crRNA e tracerRNA. Estes Cas9/RNPs são capazes de clivagem genômicos alvos com maior eficiência em comparação com abordagens de DNA-dependente estrangeiras devido a sua entrega como complexos funcionais. Além disso, liberação rápida de Cas9/RNPs das células pode reduzir os efeitos de fora do alvo como a indução da apoptose. Assim, eles podem ser usados para gerar nocautes, ou bater-ins quando combinado com o DNA para o recombination homologous6,7. Nós mostramos que eletroporação de Cas9/RNPs é um método fácil e relativamente eficiente que supera as limitações anteriores de modificação genética em células NK.
TGFβ é uma principais citocinas imunossupressoras, que inibe a ativação e funções das células NK. Tem sido sugerido que o direcionamento da via TGFβ pode aumentar funções de células imunes. Escolhemos a região de codificação TGBR2 ectodomínio que vincula TGFβ11. Os resultados representativos mostram uma diminuição significativa no nível de expressão de RNAm de um gene e ainda demonstram que as células NK modificadas se tornam resistentes aos TGFβ. Além disso, as células modificadas mantém viabilidade e potencial proliferativo, como eles são capazes de ser expandido post-electroporation usando células irradiadas alimentador. Portanto, o método a seguir é uma abordagem promissora para manipular geneticamente células NK para qualquer mais clínico ou fins de investigação.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modificação de dependente de DNA das células NK tem sido desafiador4,9. Portanto, introduzimos diretamente um complexo ribonucleoprotein sinteticamente pré-formadas (RNPs) e proteína Cas9 como proteína purificada no de células NK primárias e expandida8. Este método permitiu-na eliminar tampando, seguindo, e outros processos transcricionais e translacionais começaram pela RNA polimerase II, que pode causar apoptose de células NK …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos o Brian Tullius por sua gentil ajuda em editar o manuscrito.
Materials
| RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15065 | The RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection. |
| Ficoll-Paque® PLUS | GE Healthcare – Life Sciences | 17-1440-02 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072532 | TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA | Integrated DNA Technologies | Synthetically produced as Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest | |
| Alt-R® Genome Editing Detection Kit | Integrated DNA Technologies | 1075931 | Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls. |
| Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304-011 | |
| 4D-Nucleofector™ System | Lonza | AAF-1002B | |
| Human recombinant IL-2 Protein | Novartis | 65483-0116-07 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit | Lonza | V4XP-3032 | Contains pmaxGFP™ Vector, Nucleofector™ Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette™ Strips |
| Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus | Dharmacon | CTM-360019 | |
| Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1074181 | Cas9 Nuclease |
| DNeasy® Blood & Tissue Handbook | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | |
| TGFβ | Biolegend | 580706 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Human | Integrated DNA Technologies | 1072554 | Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer. |
| IDTE pH 7.5 (1X TE Solution) | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
| Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | Cas9 Electroporation Enhancer |
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