توصيف ميكروبيومي التجزئة بالتسلسل Amplicon الرنا الريباسي 16S الجيل المقبل
Summary
نقدم هنا بروتوكول الجيل التالي تسلسل لتسلسل الرنا الريباسي 16S التي تمكن من تحديد وتوصيف المجتمعات الميكروبية داخل الناقلة. هذا الأسلوب ينطوي على استخراج الحمض النووي والتضخيم والمتوازية من عينات عن طريق PCR، تسلسل تدفق الخلايا، والمعلوماتية الحيوية لمطابقة البيانات تسلسل المعلومات النشوء والتطور.
Abstract
في العقود الأخيرة، ظهرت من جديد الأمراض المحمولة بالنواقل والتوسع في معدلات، تسبب قدرا كبيرا من المراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم المفزعة. لا توجد لقاحات فعالة ومتاحة على نطاق واسع لغالبية هذه الأمراض، مما يستلزم وضع استراتيجيات التخفيف من آثار المرض الرواية. وتحقيقا لهذه الغاية، يشمل واعدة لمكافحة الأمراض استهداف ميكروبيومي ناقل، مجتمع الميكروبات التي تسكن في ناقلات. ميكروبيومي ناقلات يلعب دوراً محوريا في ديناميات الكائنات الممرضة، والتلاعب ميكروبيومي أدت إلى انتقال ناقلات انخفاض وفرة أو الممرض لحفنة من الأمراض المحمولة بالنواقل. بيد أن ترجمة هذه النتائج إلى تطبيقات التحكم المرض يتطلب فهم شامل لمكافحة ناقلات الإيكولوجيا الميكروبية، محدودة تاريخيا بتكنولوجيا غير كافية في هذا المجال. قد مكن ظهور نهج الجيل التالي تسلسل تسلسل المتوازية العالية والسريعة للمجتمعات الميكروبية المختلفة. استهداف الجين الرنا الريباسي 16S المحافظة جداً سهلت الأوصاف للميكروبات موجودة داخل ناقلات تحت اختلاف الظروف الإيكولوجية والتجريبية. هذا الأسلوب ينطوي على تضخيم الجينات الرنا الريباسي 16S، المتوازية نموذج عن طريق PCR، تحميل عينات على خلية تدفق للتسلسل، ونهج المعلوماتية الحيوية لمطابقة تسلسل البيانات مع معلومات النشوء والتطور. عادة ما يمكن الأنواع أو تحديد مستوى جنس لعدد كبير من replicates من خلال هذا النهج، وبالتالي الالتفاف حول التحديات للكشف عن انخفاض والقرار الناتج من استزراع التقليدية، والفحص المجهري، أو تلطيخ نسيجية تقنيات. ولذلك، هذا الأسلوب مناسبة تماما لوصف ناقلات الجراثيم تحت ظروف متنوعة ولكن حاليا لا يمكن تقديم معلومات عن وظيفة الميكروبية، موقع داخل ناقل، أو استجابة للعلاج بالمضادات الحيوية. عموما، تسلسل الجيل القادم 16S تقنية قوية لفهم أفضل للهوية ودور ناقلات الجراثيم في ديناميات المرض.
Introduction
أن عودة ظهور وانتشار الأمراض المحمولة بالنواقل في العقود الأخيرة تشكل تهديدا خطيرا لصحة الإنسان والحياة البرية العالمية. ولا توجد لقاحات فعالة لغالبية هذه الأمراض، وتعيق جهود مكافحة الطبيعة البيولوجية المعقدة ناقلات والتفاعلات ناقل المضيف. فهم دور التفاعلات الميكروبية داخل ناقل في انتقال العوامل الممرضة يمكن أن تسمح لوضع استراتيجيات جديدة والتحايل على هذه التحديات. على وجه الخصوص، التفاعلات بين المرتبطة بمكافحة ناقلات الجراثيم كومينسالس، وسيمبيونتس، ومسببات الأمراض، يشار إلى ميكروبيومي، قد آثار هامة على انتقال العوامل الممرضة. الآن أدلة دامغة تؤيد هذا الزعم، مع أمثلة مما يدل على ارتباط بين ناقلات ميكروبيومي والكفاءة لأمراض من قبيل الملاريا وفيروس زكى، ومرض لايم1،،من23. بيد أن ترجمة هذه النتائج إلى استراتيجيات للسيطرة على الأمراض يتطلب فهم أكثر تفصيلاً لهيكل ووظيفة، ومنشأ متجه ميكروبيوميس. تحديد وتوصيف المجتمع ناقلات الجراثيم تحت اختلاف الظروف الإيكولوجية والتجريبية تشكل مسار هامة إلى الأمام في هذا المجال.
وضع إجراء لتحديد السكان الميكروبية ناقل الممرض يرد هنا باستخدام الغربية أرجل الأسود القراد، باسيفيكوس Ixodes، أنواع ناقلات الأمراض من مسببات المرض مرض لايم البورليه burgdorferi. بينما القراد تأوي أكثر من أنواع مسببات الأمراض البشرية من أي مفصليات الأرجل الأخرى، يعرف سوى القليل نسبيا هو حول إيكولوجيا الأحياء والمجتمع للقراد ميكروبيوميس4. فمن الواضح أن القراد إيواء مجموعة متنوعة من الفيروسات والبكتيريا والفطريات وبرزويات التي تشمل كومينسالس، اندوسيمبيونتس، وسكان الميكروبية عابر5،4. العمل السابقة أظهرت اختلافات قوية في ميكروبيوميس إيكسوديس المرتبطة بالجغرافيا، والأنواع، والجنس ومرحلة الحياة ووجبة الدم مصدر6،،من78. ولكن الآليات الكامنة وراء هذا الاختلاف لا تزال مجهولة وتبرر أكثر تفصيلاً بالتحقيقات المتعلقة بمنشأ والجمعية هذه المجتمعات الميكروبية. القراد يمكن أن تكتسب الميكروبات عن طريق الانتقال الرأسي، الاتصال بالمضيفين، وامتصاص من البيئة من خلال spiracles والفم، والشرج المسام9. فهم العوامل التي تشكل الأولية تشكيل وتطوير ميكروبيومي القراد، على وجه التحديد المساهمة النسبية لانتقال العدوى الرأسية والبيئية، مهم لفهم الأنماط الطبيعية والتغيرات في التجزئة ميكروبيومي التنوع وكيفية تفاعل هذه المجتمعات أثناء انتقال مسببات المرض، مع التطبيقات الممكنة لمكافحة المرض أو ناقل.
التقنيات الجزيئية القوية، مثل الجيل التالي التسلسل، الآن موجودة لتحديد المجتمعات الميكروبية ويمكن استخدامها لتوصيف ميكروبيوميس ناقل تحت مختلف الظروف البيئية أو التجريبية. قبل ظهور هذه النهج التسلسل الفائق، تحديد الميكروبات تعتمد غالباً على الفحص المجهري والثقافة. أن الفحص المجهري تقنية سريعة وسهلة، فالطرق المورفولوجية للتعرف على الميكروبات طبيعتها الذاتية والخشنة ومحدودة بحساسية منخفضة والكشف عن10. الأساليب المستندة إلى الثقافة وتستخدم على نطاق واسع لتحديد العوامل الجرثومية ويمكن استخدامها لتحديد حساسية الجراثيم للمخدرات العلاجات11. ومع ذلك، هذا الأسلوب أيضا يعاني من حساسية منخفضة، حيث يقدر أن أقل من 2% ميكروبات البيئية يمكن أن تكون مثقف في مختبر لإعداد12. كما استخدمت النهج المصبوغة النسيجي كشف وتعريب الميكروبات محددة داخل الناقلة، وتمكين تحقيقات توزيعات الأنواع المختلفة داخل القراد ودراسة فرضيات حول التفاعلات الميكروبية. المعرفة المسبقة بهوية الميكروبية غير مطلوبة من أجل تحديد البقع الملائمة، مما يجعل هذا النهج غير ملائمة لتوصيف الميكروبية وتحديد الهوية. وعلاوة على ذلك، تلطيخ نسيجية عملية الوقت كثيفة جداً وشاقة وغير مقياس جيد للعينات ذات الأحجام الكبيرة. النهج الجزيئية التقليدية مثل سانغر التسلسل وبالمثل محدودة في الحساسية والكشف عن مختلف المجتمعات الميكروبية.
تسلسل الجيل التالي يسمح للتعرف السريع على الميكروبات من عدد كبير من العينات. تعزيز وجود الجينات علامة قياسية ومرجعية قواعد بيانات أخرى تمكن قرار التقسيم، غالباً على مستوى جنس أو الأنواع. وحدة فرعية صغيرة الريباسي الكشف كثيرا ما تستخدم لتحقيق هذا الهدف، مع الرنا الريباسي 16S ويجري الأكثر شيوعاً نظراً لوجود المناطق المصانة ومتغير داخل الجينات، السماح بإنشاء أجهزة الإشعال العالمي مع أمبليكونس فريدة من نوعها لكل البكتيريا الأنواع13،14. يتضمن هذا التقرير تفاصيل إجراء لتحديد الأصناف في ميكروبيومي التجزئة من خلال تسلسل الجيل الرنا الريباسي 16S. على وجه الخصوص، يؤكد هذا البروتوكول على الخطوات المتبعة في إعداد العينات للتسلسل. المعمم المزيد من التفاصيل بشأن التسلسل والمعلوماتية الحيوية يتم توفير الخطوات، كما أن هناك مجموعة متنوعة من منصات يسلسل وتحليل البرامج المتاحة حاليا، كل مع الوثائق الحالية واسعة النطاق. ويتجلى عموما جدوى هذا النهج الجيل التالي تسلسل تطبيقه تحقيقا للجمعية المجتمع الميكروبي داخل ناقل مرض رئيسية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الجيل التالي تسلسل الرنا الريباسي 16S أصبح نهجاً موحدا لتحديد العوامل الجرثومية ومكنت الدراسة كيف ميكروبيوميس ناقلات الأمراض تؤثر على انتقال العوامل الممرضة. تفاصيل البروتوكول المبينة هنا استخدام هذا الأسلوب للتحقيق في الجمعية المجتمع الميكروبي في باسيفيكوس أولاً، نوع ناقل لمرض لا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان تدعمها “المؤسسة الوطنية للعلوم” منحا إلى أ. س. (ديب #1427772، 1745411، 1750037).
Materials
| Item | Name of Material/Equipment | Company | Catalog # |
| 1 | DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| 2 | Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q3326 |
| 3 | NanoDrop 8000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-8000-GL |
| 4 | 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems | KK2501 |
| 5 | AMPure XP beads | Agen Court | A63880 |
| 6 | Magnetic Rack | ThermoFisher Scientific | MR02 |
| 6 | TE buffer | Teknova | T0223 |
| 7 | Nextera Index Kit | Illumina | FC-121-1011 |
| 8 | KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 |
| 9 | MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 |
| 10 | MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
| 11 | 10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20 | Teknova | T7724 |
References
- Dong, Y., Manfredini, F., Dimopoulos, G. Implication of the mosquito midgut microbiota in the defense against malaria parasites. Public Library of Science Pathogens. 5 (5), (2009).
- Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., Osorio, J. E. The wMel strain of Wolbachia reduces transmission of Zika virus by Aedes aegypti. Scientific Reports. 6 (July), 1-7 (2016).
- Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the Lyme disease spirochete. Cell Host and Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
- Clay, K., Fuqua, C. The Tick Microbiome: Diversity, Distribution and Influence of the Internal Microbial Community for a Blood-Feeding Disease Vector. Critical Needs and Gaps in Understanding Prevention, Amelioration, and Resolution of Lyme and Other Tick-Borne Diseases: The Short-Term and Long-Term Outcomes. , 1-22 (2010).
- Noda, H., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Endosymbionts of Ticks and Their Relationship to Wolbachia spp. and Tick-Borne Pathogens of Humans and Animals. Applied and Environmental Microbiology. 63 (10), 3926-3932 (1997).
- van Treuren, W., et al. Variation in the microbiota of Ixodes ticks with regard to geography, species, and sex. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6200-6209 (2015).
- Swei, A., Kwan, J. Y. Tick microbiome and pathogen acquisition altered by host blood meal. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 11 (3), 813-816 (2017).
- Kwan, J. Y., Griggs, R., Chicana, B., Miller, C., Swei, A. Vertical vs. horizontal transmission of the microbiome in a key disease vector, Ixodes pacificus. Molecular Ecology. 26 (23), 6578-6589 (2017).
- Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: The force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
- Houpikian, P., Raoult, D. Traditional and molecular techniques for the study of emerging bacterial diseases: One laboratory’s perspective. Emerging Infectious Diseases. 8 (2), 122-131 (2002).
- Kotsilkov, K., Popova, C., Boyanova, L., Setchanova, L., Mitov, I. Comparison of culture method and real-time PCR for detection of putative periodontopathogenic bacteria in deep periodontal pockets. Biotechnology and Biotechnological Equipment. 29 (5), 996-1002 (2015).
- Wade, W. Unculturable bacteria – The uncharacterized organisms that cause oral infections. Journal of the Royal Society of Medicine. 95 (2), 81-83 (2002).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Research. 41 (1), 1-11 (2013).
- Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: Pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
- Falco, R. C., Fish, D. A comparison of methods for sampling the deer tick, Ixodes dammini, in a Lyme disease endemic area. Experimental & Applied Acarology. 14 (2), 165-173 (1992).
- Patrick, C. D., Hair, J. A. Laboratory rearing procedures and equipment for multi-host ticks (Acarina: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 12 (3), 389-390 (1975).
- Köchl, S., Niederstätter, H., Parson, W. DNA extraction and quantitation of forensic samples using the phenol-chloroform method and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 297, 13-30 (2005).
- Wallace, D. M., Berger, S. L., Kimmel, R. Large- and small- scale phenol extractions. Guide to molecular cloning techniques. 18, 33-41 (1987).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
- Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. BioTechniques. 10, 506-518 (1991).
- Gariepy, T. D., Lindsay, R., Ogden, N., Gregory, T. R. Identifying the last supper: utility of the DNA barcode library for bloodmeal identification in ticks. Molecular Ecology Resources. 12, 646-652 (2012).
- Ammazzalorso, A. D., Zolnik, C. P., Daniels, T. J., Kolokotronis, S. O. To beat or not to beat a tick: comparison of DNA extraction methods for ticks (Ixodes scapularis). PeerJ. 3, 1-14 (2015).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- TaKara Bio. . Library Quantification Kit: User Manual. , (2018).
- Genohub. . Cluster density optimization on Illumina sequencing instruments. , (2018).
- Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (6), (2014).
- Caporaso, G. J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75, 7537-7541 (2009).
- Duguma, D., et al. Developmental succession of the microbiome of Culex mosquitoes Ecological and evolutionary microbiology. BMC Microbiology. 15 (1), 1-13 (2015).
- Fagen, J. R. Characterization of the Relative Abundance of the Citrus Pathogen Ca. Liberibacter Asiaticus in the Microbiome of Its Insect Vector, Diaphorina citri, using High Throughput 16S rRNA Sequencing. The Open Microbiology Journal. 6 (1), 29-33 (2012).
- Geiger, A., et al. First isolation of Enterobacter, Enterococcus, and Acinetobacter spp. as inhabitants of the tsetse fly (Glossina palpalis palpalis) midgut. Infection, Genetics and Evolution. 9 (6), 1364-1370 (2009).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12 (1), 1-12 (2014).
- Rand, K. H., Houck, H. Taq polymerase contains bacterial DNA of unknown origin. Molecular and Cellular Probes. 4, 445-450 (1990).
- Grahn, N., Olofsson, M., Ellnebo-Svedlund, K., Monstein, H. J., Jonasson, J. Identification of mixed bacterial DNA contamination in broad-range PCR amplification of 16S rDNA V1 and V3 variable regions by pyrosequencing of cloned amplicons. FEMS Microbiology Letters. 219, 87-91 (2003).
- Mohammadi, T., Reesink, H. W., Vandenbroucke-Grauls, C. M., Savelkoul, P. H. Removal of contaminating DNA from commercial nucleic acid extraction kit reagents. Journal of Microbiological Methods. 61, 285-288 (2005).
- Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15, 564 (2014).
- Paulson, J. N., Stine, O. C., Bravo, H. C., Pop, M. Differential abundance analysis for microbial marker-gene surveys. Nature Methods. 10 (12), 1200-1202 (2013).
- Weiss, S., et al. Normalization and microbial differential abundance strategies depend upon data characteristics. Microbiome. 5 (1), 1-18 (2017).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. Waste Not, Want Not: Why Rarefying Microbiome Data Is Inadmissible. Public Library of Science Computational Biology. 10 (4), (2014).
- Edmonds, K., Williams, L. The role of the negative control in microbiome analyses. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 23 (Suppl 1), (2017).
- Gall, C. A., et al. The bacterial microbiome of Dermacentor andersoni ticks influences pathogen susceptibility. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10, 1846-1855 (2016).
- Gofton, A. W., et al. Inhibition of the endosymbiont "Candidatus Midichloria mitochondrii" during 16S rRNA gene profiling reveals potential pathogens in Ixodes ticks from Australia. Parasites & Vectors. , 1-11 (2015).
- Pruesse, E., et al. SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Research. 35, 7188-7196 (2007).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and Environmental Microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
- Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 37, D141-D145 (2009).
- Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Wheeler, D. L. GenBank. Nucleic Acids Research. 34, D16-D20 (2006).
- Schloss, P. D. The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies. Public Library of Science Computational Biology. 6 (7), 19 (2010).
- Balvočiute, M., Huson, D. H., SILVA, R. D. P. Greengenes, NCBI and OTT – how do these taxonomies compare?. BMC Genomics. 18 (Suppl 2), 1-8 (2017).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
