次世代の 16S rRNA 増幅シーケンスによる目盛りマイクロバイ評価
Summary
16S rRNA 配列ベクトル内で微生物の同定と解析を可能にするための次世代シーケンス プロトコルをご紹介します。このメソッドには、DNA 抽出、増幅し、pcr 法によって、フローセルとバイオインフォマティクスをシーケンス処理シーケンス データを系統情報に合わせてサンプルのバーコードが含まれます。
Abstract
最近十年間に媒介性疾患が再登場し、驚くべき速度、かなり罹患率と死亡率の世界の原因で展開します。効果的な広く利用可能なワクチンは、小説病軽減戦略の開発を必要とこれらの疾患の大部分の欠けています。この目的のためには、疾病の有望な道は、ベクトル マイクロバイ、ベクターに棲息する微生物のコミュニティを対象とする場合します。ベクトル マイクロバイ病原体ダイナミクスにおける極めて重要な役割を果たしているし、マイクロバイの操作は、ベクトル耐えられた病気の一握りの減らされたベクトルの豊富なまたは病原体伝送につながっています。ただし、病気、制御アプリケーションにこれらの調査結果を翻訳ベクトル微生物生態学、この分野で十分な技術によって歴史的に制限の徹底理解が必要です。次世代シーケンス アプローチの出現は、多様な微生物の迅速、高並列シーケンスを可能にしました。非常に節約される 16S rRNA 遺伝子をターゲットと変化する生態学的、実験条件の下でベクトル内に存在する細菌の特性を促進しています。この技法が PCR のシーケンス、フローセルに読み込みサンプルによってサンプル バーコード 16S rRNA 遺伝子の増幅とバイオインフォマティクスの系統情報を持つシーケンス データを一致するようにアプローチします。種または複製の高数の属レベルでの識別はこのアプローチにより、検出、解決、および伝統的な培養、顕微鏡、または組織学的染色からの出力の課題を回避通常達成することができます。テクニック。したがって、このメソッドはベクトル微生物多様な条件下での特性評価に最適ですが、現在微生物機能、ベクトル、または抗生物質による治療への応答内の場所に関する情報を提供できません。全体的にみて、16 次世代シーケンサーは、アイデンティティとベクトル病気ダイナミクスにおける微生物の役割を理解強力な手法です。
Introduction
復活と最近十年間に媒介性疾患の広がり世界的な人間と野生動物の健康に深刻な脅威をもたらします。効果的なワクチンは、これらの疾患の大部分の欠けているし、コントロールの努力はベクトルとベクトル ホスト相互作用の複雑な生物学的性質によって妨げられます。これらの課題を回避する新しい戦略の開発のため病原体の感染でベクター内微生物相互作用の役割を理解することができます。特に、ベクター関連微生物共生生物と共生、マイクロバイと呼ばれる病原体の相互作用は、病原体の感染に重要な結果があります。圧倒的な証拠を今、ベクトル マイクロバイ オームおよびライム病1,2,3ジカ、マラリアなどの病気のための能力の間のリンクを示す例とこのアサーションをサポートします。ただし、疾病管理のための戦略にこれらの調査結果を翻訳構造、関数、およびベクター内細菌叢解析の起源のはるかに詳細な理解が必要です。変化する生態学的なおよび実験条件下でのベクトルの微生物コミュニティの同定と解析進むこの分野で重要なパスを構成します。
病原体のベクトルの微生物の居住者を識別するためのプロシージャは、西黒脚ダニセイブクロアシマダニライム病ライム病病原体の媒介種を利用してここで提供されます。ダニは、他の節足動物以上の人間の病原体の種類港中、比較的ティック内細菌叢解析4の生物学およびコミュニティの生態について少し知られています。ダニがウイルス、細菌、菌類、原生動物によって、共生、一過性微生物住民5,4などの多様な配列を抱くことは明らかです。前の仕事は、地理、種、セックス、ライフ ステージ、吸血ソース6,7、8に関連付けられているマダニ内細菌叢解析に強い変化を実証しています。しかし、この変化の基になるメカニズムは不明のまま、起源の調査とこれらの微生物コミュニティのアセンブリの詳細を保証します。ダニは垂直感染微生物を得ることができるホスト、気門、口、アナル孔9を通じて環境から吸収と接触。初期形成とティック マイクロバイの開発の形成要因を理解するには、相対的な上下環境伝送、具体的には目盛りの変化、自然なパターンを理解するために重要ですマイクロバイの多様性と疾患またはベクター コントロールに適用できるの病原体感染中のこれらのコミュニティの対話方法。
次世代シーケンスなどの強力な分子技術は今微生物を識別するため存在し、多様な環境や実験条件の下でベクトル内細菌叢解析を特徴づけるために用いることができます。これらの高スループット シーケンスのアプローチの出現で、前に微生物の同定は顕微鏡と文化主に依存。顕微鏡検査は迅速かつ簡単な方法が、微生物を識別するための形態学的方法は本質的に主観的な粗と低感度と検出10によって限られました。文化ベースのメソッドは微生物同定のため広く使用されて、薬物治療11微生物の感受性を決定するため使用することができます。ただし、このメソッドも、感度が低いと苦しんで環境微生物の 2% 未満を設定12研究室で培養できることが推定されています。組織の染色方法は、検出し、ベクトル内の特定微生物をローカライズ、ダニの内様々 な分類群の分布の調査を有効にして微生物の相互作用についての仮説を研究に採用されています。ただし、微生物のアイデンティティの知識はこのアプローチを作る微生物の特性と同定適して適切な汚れを選択するため必要です。さらに、組織染色は非常に時間がかかり、骨の折れるプロセスであり大規模なサンプル サイズにも対応していません。シーケンスは、感度と多様な微生物の検出に限られている同様にサンガーなど従来の分子アプローチ。
次世代シーケンサーは、サンプル数が多いから微生物の迅速同定のためことができます。標準的なマーカー遺伝子のデータベースをさらに有効に参照の存在は、属や種のレベルに多くの分類学的解像度を増強しました。リボソームの小サブユニット Rna は、16 s rRNA の遺伝子領域を節約され、変数の存在のために最も一般的である各細菌のユニークな産物と普遍的なプライマーを作成すると、この目標を達成するためによく使用されます。種13,14。このレポートは 16S rRNA 次世代シーケンスをティック マイクロバイのイチイを識別するための手順を詳しく説明します。特に、このプロトコルは、シークエンシングのためのサンプルを準備するための手順を強調します。もっと一般化順序の詳細については、バイオインフォマティクスの手順提供されており、現在利用可能なさまざまなシーケンスのプラットフォームおよび解析プログラムがあるのでそれぞれ豊富な既存ドキュメント。この次世代シーケンサー アプローチの全体的な可能性が主病のベクター内の微生物群集構造アセンブリの調査に適用することによって実証します。
Protocol
Representative Results
Discussion
16S rRNA の次世代シーケンシング、微生物同定のための標準的なアプローチになるし、病原体の感染に影響を与えるベクトル内細菌叢解析の研究。ここで説明したプロトコル詳細I. スルメライム病の媒介種の微生物コミュニティ アセンブリを調査するこのメソッドを使用してただし、他のカチカチ種または節足動物媒介種勉強に簡単に適用することができます。
確?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業によって支えられた全米科学財団は a. s. (DEB #1427772、1745411、1750037) に付与します。
Materials
| Item | Name of Material/Equipment | Company | Catalog # |
| 1 | DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| 2 | Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q3326 |
| 3 | NanoDrop 8000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-8000-GL |
| 4 | 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems | KK2501 |
| 5 | AMPure XP beads | Agen Court | A63880 |
| 6 | Magnetic Rack | ThermoFisher Scientific | MR02 |
| 6 | TE buffer | Teknova | T0223 |
| 7 | Nextera Index Kit | Illumina | FC-121-1011 |
| 8 | KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 |
| 9 | MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 |
| 10 | MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
| 11 | 10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20 | Teknova | T7724 |
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