Tick Microbiome karakterisering av neste generasjons 16S rRNA Amplicon sekvenser

Summary

Her presenterer vi en neste generasjons sekvensering protokoll for 16S rRNA sekvensering som gjør identifisering og karakterisering av mikrobielle samfunn i vektorer. Denne metoden innebærer DNA utvinning, forsterkning og barcoding av prøver gjennom PCR, sekvensering flyt-celle og bioinformatikk å matche sekvens data til phylogenetic informasjon.

Abstract

I de siste tiårene, har vektor-sykdommer igjen dukket opp og utvidet på urovekkende priser, forårsaker betydelig sykelighet og dødelighet verden. Effektiv og lett tilgjengelige vaccines mangler for et flertall av disse sykdommer, nødvendiggjør utviklingen av Roman sykdom forminskingsmodulen strategier. Dette innebærer en lovende avenue sykdom kontroll målretting vektor microbiome, fellesskapet av mikrober som bor vektoren. Vector microbiome spiller en sentral rolle i patogen dynamics og manipulering av microbiome har ført til redusert vektor overflod eller patogen overføring for en håndfull vektor-sykdommer. Men krever oversette disse funnene i sykdom kontroll programmene en grundig forståelse av vektor microbial ecology, historisk begrenset av utilstrekkelig teknologi på dette området. Bruk av neste generasjons sekvensering metoder har aktivert rask, svært parallelle sekvenser av ulike mikrobielle samfunn. Målretting svært bevart 16S rRNA genet har muliggjort characterizations av mikrober stede i vektorer under varierende økologiske og eksperimentelle forhold. Denne teknikken innebærer forsterkning av 16S rRNA genet, prøve barcoding via PCR, lasting eksempler på en flyt for sekvensering, og bioinformatikk tilnærminger tilsvarer sekvens databehandling Fylogenetiske informasjon. Art eller slekt nivå identifikasjon for et høyt tall av replikat kan vanligvis oppnås gjennom denne metoden, og dermed omgå utfordringene i lav oppdagelsen, oppløsning og utdata fra tradisjonelle dyrking, mikroskopi eller histologiske flekker teknikker. Derfor denne metoden er velegnet for å karakterisere vektor mikrober under ulike forhold, men for tiden gir ikke informasjon om mikrobiell funksjon, sted vektor, eller svar på antibiotikabehandling. Total, 16S neste generasjons sekvensering er en kraftfull teknikk for å bedre forstå identitet og rollen av vektor mikrober i sykdom dynamics.

Introduction

Fremveksten og spredningen av vektor-sykdommer i de siste tiårene utgjør en alvorlig trussel mot global menneske og dyr helse. Effektive vaksiner mangler for et flertall av disse sykdommene, og kontroll innsats er hindret av komplekse biologiske natur vektorer og vektor-vert interaksjoner. Forståelsen av mikrobielle interaksjoner i en vektor i patogen overføring kan tillate utviklingen av romanen strategier som omgå disse utfordringene. Spesielt kan interaksjoner mellom vektor-assosiert mikrobiell commensals og symbionter patogener, kalles microbiome, ha viktige konsekvenser for patogen overføring. Overveldende bevis nå støtter denne påstanden, med eksempler som demonstrerer et koblingen mellom vektor microbiome og kompetanse for sykdommer som malaria og Zika virus Lyme sykdom^1,2,3. Oversette disse funnene i strategier for Skadekontroll krever imidlertid en langt mer detaljert forståelse av strukturen, funksjon og opprinnelsen til vektor microbiomes. Identifikasjon og karakterisering av vektor mikrobiell samfunnet under varierende økologiske og eksperimentelle forhold utgjør et viktig vei fremover i dette feltet.

En prosedyre for å identifisere mikrobiell innbyggerne i en patogen vektor tilbys her ved å bruke Western black legged kryss, Ixodes pacificus, vector art av patogen Lyme sykdom Borrelia burgdorferi. Mens flått havn flere typer mennesker enn noen andre leddyr, er relativt lite kjent om biologi og samfunnet økologi tick microbiomes⁴. Det er tydelig at flått havn en variert utvalg av virus, bakterier, sopp og protozoans inkluderer commensals, endosymbionts og forbigående mikrobiell beboere^5,4. Tidligere arbeid har vist sterk variasjoner i Ixodes microbiomes forbundet med geografi, arter, sex, liv Stadium og blod måltid kilde^6,7,8. Imidlertid mekanismene bak denne varianten er fortsatt ukjent og garanterer mer detaljerte undersøkelser av opprinnelsen og montering av disse mikrobielle samfunn. Flått kan skaffe mikrober gjennom vertikal overføring, kontakt med verter og opptak fra miljøet gjennom voksne, munn og anal pore⁹. Forstå faktorer forme første dannelsen og utviklingen av tick microbiome, er spesielt relative bidrag loddrett og miljømessige overføring, viktig for å forstå den naturlige mønstre og variasjoner i kryss Microbiome mangfold og hvordan disse samfunnene samhandle i patogen overføring, med mulige programmer sykdom eller vektor.

Kraftig molekylær teknikker, som neste generasjons sekvensering, nå eksisterer for å identifisere mikrobielle samfunn og kan brukes til å karakterisere vektor microbiomes under ulike miljømessige eller eksperimentelle forhold. Før ankomsten av disse høy gjennomstrømming sekvensering tilnærminger avhengig identifikasjon av mikrober hovedsakelig mikroskopi og kultur. Mikroskopi er en rask og enkel teknikk, er morfologiske metoder for å identifisere mikrober iboende subjektiv og grov og begrenset av lav sensitivitet og gjenkjenning¹⁰. Kultur-baserte metoder brukes generelt for mikrobiell identifisering og kan brukes til å bestemme mottakelighet av mikrober til narkotika behandlinger¹¹. Men lider denne metoden også av lav følsomhet, som det har blitt anslått at færre enn 2% av miljømessige mikrober kan kultivert i et laboratorium sette¹². Histologiske flekker tilnærminger har også vært ansatt å oppdage og lokalisere bestemt mikrober innen vektorer, aktiverer undersøkelser av ulike taxa distribusjoner i haken og studere hypoteser om mikrobiell interaksjoner. Forkunnskaper mikrobiell identitet er imidlertid nødvendig for å velge riktig flekker, gjør denne tilnærmingen dårlig tilpasset for mikrobiell karakterisering og identifikasjon. Videre histologiske flekker er en svært tidkrevende, arbeidskrevende prosess og skalere ikke godt for store. Tradisjonelle molekylær tilnærminger som Sanger sekvensering er tilsvarende begrenset i sin følsomhet og påvisning av ulike mikrobielle samfunn.

Neste generasjons sekvensering tillater rask identifisering av mikrober fra mange eksempler. Standard markør gener og referanse databaser ytterligere muliggjør forbedret taksonomisk oppløsning, ofte til slekten eller arter. Liten delenhet ribosomal RNAs brukes ofte til å oppnå dette målet, med 16S rRNA er den vanligste av bevarte og variable regioner i genet, slik at etableringen av universell primere med unik amplicons for hver bakteriell Art^13,14. Denne rapporten viser en prosedyre for å identifisere taxa i kryss microbiome gjennom 16S rRNA neste generasjons sekvensering. Spesielt understreker denne protokollen trinnene involvert i forbereder prøver sekvensering. Mer generalisert informasjon om sekvensering og bioinformatikk trinnene vises, som det er en rekke sekvensering plattformer og analyse programmer tilgjengelig, med omfattende eksisterende dokumentasjon. Generelle muligheten for denne neste generasjons sekvensering er demonstrert ved å bruke det på en undersøkelse av mikrobielle samfunn montering i en nøkkel sykdom vektor.

Protocol

1. sjekke innsamling og overflaten sterilisering Samle flått ved å dra en 1 m2 hvit klut over et kryss-assosiert habitat, fjerne flått knyttet til verten arter, eller oppdrett flått i lab15,16. Bruke fine tang manipulere flått og lagre dem på-80 ° C. Plasser flått i individuelle PCR rør og fjerne overflaten smuss ved vortexing for 15 s suksessivt med 500 μL hydrogenperoksid (H2O2), 70% etanol og ddH<s…

Representative Results

Totalt 42 flått fra tre separate egg clutches og to miljømessige eksponering perioder, 0 og 2 uker i jord, ble behandlet for microbiome sekvensering. Hver behandlingsgruppe, anses å være en enkelt clutch og eksponering tid, inneholdt 6-8 gjenskape tick prøver. Disse behandlet tick ekstrakter var lastet inn en neste generasjons sequencer og gitt 12,885,713 sammen-end leser passerer filteret. Inkludert i dette løpet var 3 negative kontroller fra utvinning trinn, gir totalt 211,214 les…

Discussion

Neste generasjons sekvensering av 16S rRNA har blitt en standard tilnærming for mikrobiell identifikasjon og aktivert studiet av hvordan vektor microbiomes påvirker patogen overføring. Protokollen skissert her viser bruk av denne metoden å undersøke mikrobiell samfunnet montering i I. pacificus, vector art for Lyme sykdom; men kan det lett brukes for å studere andre kryss arter eller leddyr vector art.

Faktisk, 16S rRNA sekvenser for microbiome analyse er brukt grovt å studere …

Materials

Item	Name of Material/Equipment	Company	Catalog #
1	DNeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69504
2	Qubit 4 Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q3326
3	NanoDrop 8000 Spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	ND-8000-GL
4	2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Kapa Biosystems	KK2501
5	AMPure XP beads	Agen Court	A63880
6	Magnetic Rack	ThermoFisher Scientific	MR02
6	TE buffer	Teknova	T0223
7	Nextera Index Kit	Illumina	FC-121-1011
8	KAPA Library Quantification Kit	Roche	KK4824
9	MiSeq System	Illumina	SY-410-1003
10	MiSeq Reagent Kit v3	Illumina	MS-102-3001
11	10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20	Teknova	T7724