Арбовирусных инфекций как скрининг инструменты для выявления вирусной иммуномодуляторов и принимающих противовирусное факторов
Summary
Здесь мы представляем протоколы для идентификации 1) вирус кодировке иммунокорректоров, которые способствуют арбовирусных репликации и 2) эукариотических хост факторы, которые ограничивают арбовирусных репликации. Эти методы на основе флуоресценции и люминесценции позволяют исследователям быстро получить количественные отсчетов арбовирусных репликации в упрощенческой анализов с низкого соотношения сигнал шум.
Abstract
РНК – интерференции и редактирования на основе платформ скрининг генома широко использовались для выявления принимающей ячейки факторов, ограничивающих репликации вируса. Однако эти экраны обычно проводятся в клетках, которые естественно разрешительной для вирусного возбудителя изучается. Таким образом надежную репликацию вирусов в условиях управления может ограничить динамический диапазон этих экранов. Кроме того эти экраны могут быть не в состоянии легко определить пути сотовой обороны, которые ограничивают репликации вируса, если вирус хорошо адаптированы к хосту и способной противостоять противовирусной защиты. В этой статье мы опишем новую парадигму для изучения взаимодействия вируса хост с помощью экранов, которые центр на естественно неудачной инфекций путем арбовирусов например вирус везикулярного стоматита (ВСВ). Несмотря на виллах возможность реплицировать в широком диапазоне dipteran насекомых и млекопитающих хостов VSV проходит после вступления, неудачная инфекции в различных клеточных линий, полученных из спаривающиеся насекомых, таких как непарного шелкопряда (Lymantria dispar). Однако эти неудачной VSV инфекции можно «спасти» когда принимающей ячейки противовирусной защиты оказываются под угрозой. Мы описываем, как VSV штаммов кодирования удобно репортер генов и ограничительной л dispar клеточных линий может быть сопряжено для установки экранов для идентификации узла факторов в арбовирусных ограничение. Кроме того мы также показывают полезность этих инструментов скрининга в идентификации вирусно закодированные факторов, которые спасти VSV репликации при коинфекции или через внематочная выражения, в том числе закодированные млекопитающих вирусов. Природные ограничения VSV репликации в клетках dispar л обеспечивает высокое соотношение сигнал шум при отборе для условий, которые способствуют VSV спасения, таким образом позволяя использовать упрощенный люминесценции и флуоресценции-на основе анализов для мониторинга изменения в виллах репликации. Эти методологии являются ценными для понимания взаимосвязи между принимающей противовирусное ответы и вирусных иммунной уклонение факторов.
Introduction
Способность вируса эффективно реплицировать в конкретный узел регулируется в части наличия принимающей ячейки факторов, поддерживающих вирусный вход и репликации1. Вирус хозяйского диапазона может быть продиктовано способности вируса для счетчика сотовой противовирусной защиты, которые в противном случае будут препятствовать репликации вируса2,3. Это результат этих сложных вирусов хост взаимодействий, которые в конечном итоге решить, будет ли вирус смог завершить свой жизненный цикл в конкретный узел. Учитывая потенциально патогенные последствия для принимающей страны, если наступает вирусной репликации, важно разработать экспериментальные стратегии для дальнейшего нашего понимания ключевых вирус хост взаимодействий, которые могут нарушить баланс между неудачной и продуктивной инфекции. Изучение молекулярных особенности взаимодействия вируса хост будет важную роль в разработке новых и альтернативных противовирусное терапевтических стратегий.
С появлением РНК интерференции (RNAi)4,5 и геном-инструменты для редактирования (например., ТРИФОСФАТЫ-Cas9, цинковый палец nucleases, Таленс)6,7, он стал экспериментально целесообразно изменить выражение клеточных факторов на геном общесистемной весы и исследовать влияние этих изменений на репликацию вируса. Действительно были проведены многочисленные RNAi и геном редактирования на основе-экраны в беспозвоночных и позвоночных принимающих типы клеток, которые имеют обнародовал новые грани вирус хост взаимодействия8,9,10, 11 , 12. Эти экраны обычно используют вирусов кодирования репортеров, таких как Светлячок Люцифераза (Люк) или флуоресцентные белки (например., GFP, DsRed), которые обеспечивают удобные средства количественной оценки экспрессии вирусных генов как индикация для репликации вируса9,12. Эта стратегия позволяет исследователям для идентификации узла факторов, которые либо поощрения или раздражать вирусной репликации, что подтверждается увеличивается или уменьшается, соответственно, в Вирусный репортер сигналов9,12. Однако в подавляющем большинстве случаев, эти экраны были проведены с использованием вирусов, которые хорошо приспособлены к ячейки тип узла, в котором они изучаются. Хотя эта стратегия может быть важно для понимания coevolutionary отношений между вирусных патогенов и их естественной хостов, он создают глубокую озабоченность относительно их использования в раскрытие узла противовирусное факторов. В этих случаях увеличение в вирус репортер сигнал RNAi нокдаун ищется, или инактивации Сотовые фактор, который обычно препятствует репликации вируса. Во-первых если вирус уже способна надежно реплицировать в рассматривается в контрольных условиях клетки-хозяина, динамический диапазон экрана (то есть, способность различать между цветом фона и расширенной вирусный репортер сигналы) может быть ограничено. Во-вторых эта проблема усугубляется ситуаций, в которых вирус хорошо приспособлены к клетки-хозяина и эффективного противодействия принимающей обороны путей, которые ориентированы на экране.
Из-за выше опасения относительно взаимодействия традиционных вирус хост, методы фильтрации мы разработали новую парадигму для изучения вируса хост взаимодействий, которые использовать естественно неудачной арбовирусных инфекций в спаривающиеся насекомых клеток. Эта стратегия является производным от наблюдения, что хорошо изученных человека арбовирусами, виллах, подвергается неудачной инфекции в клетки, полученные от непарного шелкопряда (L. dispar)13. VSV естественно передается dipteran насекомыми (то есть, москитов) млекопитающих узлам и было доказано экспериментально заразить широкий спектр беспозвоночных и позвоночных хозяев в клеточной культуре и в естественных условиях14. 11-КБ отрицательный смысл одноцепочечной РНК Геном VSV кодирует пять субгеномной мРНК, которые каждый переводятся на белки, которые составляют запечатанная вириона. Однако обратный генетических систем VSV позволили создание репликации компетентных штаммов кодирования Люк или флуоресцентных белков, в дополнение к пяти природных VSV гена продуктов15,16,17. Потому что эти белки репортер не включаются в виллах вириона, они обеспечивают удобную индикацию VSV экспрессии генов, которое происходит после вступления. С помощью штаммы виллах кодирования GFP или люк, мы ранее показали что VSV экспрессии генов строго ограничены по вступлении LD652 клеток и что VSV титры не увеличить на 72 часа после инфекции (ХПИ). Напротив коинфекции LD652 клеток с VSV и млекопитающих поксвирусных vaccinia вируса (VACV), приводит к логарифмической увеличение экспрессии генов VSV и титры на этот момент времени. VACV проходит ранние экспрессии генов, репликации ДНК и конце экспрессии генов в LD652 клеток инфекции, но цикл репликации VACV в конечном счете неудачной из-за неполной вириона морфогенеза18. Большой ~ 192 kb ДНК генома VACV кодирует белки > 200, многие из которых отображать иммуномодулирующими свойствами, которые способствуют вирусной репликации через подавление принимающей иммунных реакций19. Таким образом мы предположили, что «спасение» VSV репликации в LD652 клетках, VACV коинфекции вероятно опосредовано VACV иммуномодуляторами, что препятствует л dispar ответы обычно ограничение VSV репликации. В поддержку этого обращения LD652 клеток с принимающей РНК полимеразой II ингибитор актиномицин Д спасает VSV репликации в LD652 клетках, указав, что ответы транскрипции зависимых хост блокировать VSV репликации после вступления13.
Выше наблюдения предполагают, что естественно ограничительный характер LD652 клеток VSV инфекции может обеспечить относительно низких фоновых при отборе для условий, которые повышают репортер VSV-кодированных сигналов (то есть, те, которые препятствуют хост антивирусной защиты). Здесь мы предлагаем методы использования флуоресценции или люк на основе анализов экран для условий, которые облегчают VSV ограничение в спаривающиеся клеток. Во-первых мы показываем, каким образом эти анализы может использоваться для определения факторов вирусно закодированные иммуномодулирующих, которые нарушают VSV ограничение во время экспериментов либо коинфекции или через внематочная выражение кандидат вирусные факторы. В качестве примера мы показываем, как мы использовали эти методы скрининга для выявления кодировке поксвирусных A51R белков как новое семейство иммуномодулирующих факторы спасти VSV репликации в отсутствие других поксвирусных факторы13. Во-вторых мы показываем, как RNAi скрининга в ограничительных инфекции клеток VSV-LD652 может использоваться для напрямую идентифицировать эукариотических хост факторов в арбовирусных ограничение13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описали простой флуоресценции и люминесценция-на основе анализов для условий, которые спасти VSV репликации в ограничительных спаривающиеся клеточных культур. Неудачная инфекции VSV спаривающиеся клеток создает отличное соотношение сигнал шум при опробование для выражения ге?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Д.г. была поддержана финансирование от Юго-Западного медицинского центра Университета штата Техас наделены ученых программы. Авторы благодарят Майкл Уитт (центра науки здоровья университета Теннесси) и Шон Уилан (Гарвардской медицинской школы) за предоставление VSV-DsRed и VSV-люк. Авторы также поблагодарить Гэри Luker (Мичиганского университета медицинской школы) за любезное дар штамма VACV-FL-GFP.
Materials
| 6-well tissue culture plates | CELLTREAT | 229106 | |
| 24-well tissue culture plates | CELLTREAT | 229124 | |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | C430167 | |
| Grace’s Insect Medium | Sigma | G8142 | |
| EX-CELL 420 | Sigma | 14420C | |
| Fetal Bovine Serum – Optima | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| Growth medium | 1:1 mixture of Grace's Insect Medium and EX-Cell 420 Serum-Free Medium also containing 1 % antibiotic-antimycotic solution and 10 % Fetal bovine serum | ||
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100×) | Sigma | A5955 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma | D8662 | |
| Serum Free Media (SFM) | Thermo Fisher | 10902096 | |
| Cytosine arabinoside | Sigma | C1768 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 10362100 | |
| Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Corning | 25950CQC | |
| Reporter lysis buffer 5X | Promega | E3971 | |
| Luciferase Assay Reagent | Promega | E1483 | |
| 96-Well Microplates | Corning | 3915 | |
| Mouse anti-FLAG antibody | Wako | 014-22383 | |
| Rabbit anti-firefly luciferase antibody | Abcam | ab21176 | |
| Mouse anti-actin antibody | Sigma | A2066 | |
| Mouse anti-VSV M | N/A | N/A | Dr. John Connor (Boston University) |
| Mouse anti-VACV I3L | N/A | N/A | Dr. David Evans (University of Alberta) |
| 8-well Chambered dish | Lab-Tek II | 155409 | |
| Cell viability dye | Thermo Fisher | C12881 | |
| FLUOstar microplate reader | BMG Labtech | FLUOstar | |
| Confocal microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
| Image analysis software | Olympus | v1.18 | cellSens software |
| Eppendorf 5702 ventilated centrifuge | Eppendorf | 22628102 | |
| Odyssey Fc Infrared Imaging System | Li-COR Biosciences | Odyssey Fc | |
| LD652 cells | N/A | N/A | Dr. Basil Arif (Natural Resources Canada) |
| BSC-40 cells | ATCC | CRL-2761 | |
| BHK cells | ATCC | CCL-10 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| BSC-1 cells | ATCC | CCL-26 | |
| in vitro transcription and purification kit | Thermo Fisher | AM1626 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 |
References
- Nomaguchi, M., Fujita, M., Miyazaki, Y., Adachi, A. Viral tropism. Frontiers in Microbiology. 3, 281 (2012).
- Werden, S. J., McFadden, G. The role of cell signaling in poxvirus tropism: the case of the M-T5 host range protein of myxoma virus. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1784 (1), 228-237 (2008).
- McFadden, G., Mohamed, M. R., Rahman, M. M., Bartee, E. Cytokine determinants of viral tropism. Nature Reviews: Immunology. 9 (9), 645-655 (2009).
- Silva, J. M., et al. Second-generation shRNA libraries covering the mouse and human genomes. Nature Genetics. 37 (11), 1281-1288 (2005).
- Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
- Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13 (6), 336-344 (2015).
- Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nature Reviews: Drug Discovery. 16 (6), 387-399 (2017).
- Hao, L., et al. Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication. Nature. 454 (7206), 890-893 (2008).
- Houzet, L., Jeang, K. T. Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis. Experimental Biology and Medicine. 236 (8), 962-967 (2011).
- Marceau, C. D., et al. Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens. Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).
- Savidis, G., et al. Identification of Zika Virus and Dengue Virus Dependency Factors using Functional Genomics. Cell Reports. 16 (1), 232-246 (2016).
- Panda, D., Cherry, S. Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions. Current Opinion in Virology. 2 (6), 784-792 (2012).
- Gammon, D. B., et al. A single vertebrate DNA virus protein disarms invertebrate immunity to RNA virus infection. Elife. 3, (2014).
- Letchworth, G. J., Rodriguez, L. L., Del cbarrera, ., J, Vesicular stomatitis. Veterinary Journal. 157 (3), 239-260 (1999).
- Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (18), 8388-8392 (1995).
- Cureton, D. K., Massol, R. H., Saffarian, S., Kirchhausen, T. L., Whelan, S. P. Vesicular stomatitis virus enters cells through vesicles incompletely coated with clathrin that depend upon actin for internalization. PLoS Pathogens. 5 (4), e1000394 (2009).
- Duntsch, C. D., et al. Recombinant vesicular stomatitis virus vectors as oncolytic agents in the treatment of high-grade gliomas in an organotypic brain tissue slice-glioma coculture model. Journal of Neurosurgery. 100 (6), 1049-1059 (2004).
- Li, Y., Yuan, S., Moyer, R. W. The non-permissive infection of insect (gypsy moth) LD-652 cells by Vaccinia virus. Virology. 248 (1), 74-82 (1998).
- Seet, B. T., et al. Poxviruses and immune evasion. Annual Review of Immunology. 21, 377-423 (2003).
- Cotter, C. A., Earl, P. L., Wyatt, L. S., Moss, B. Preparation of Cell Cultures and Vaccinia Virus Stocks. Current Protocols in Microbiology. 39, 11-18 (2015).
- Andrei, G., et al. Cidofovir resistance in vaccinia virus is linked to diminished virulence in mice. Journal of Virology. 80 (19), 9391-9401 (2006).
- Dascher, C., VanSlyke, J. K., Thomas, L., Balch, W. E., Thomas, G. Preparation of recombinant vaccinia virus for expression of small GTPases. Methods in Enzymology. , 174-188 (1995).
- Martin, A., Rex, E. A., Ishidate, T., Lin, R., Gammon, D. B. Infection of Caenorhabditis elegans with Vesicular Stomatitis Virus via Microinjection. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
- Luker, K. E., Hutchens, M., Schultz, T., Pekosz, A., Luker, G. D. Bioluminescence imaging of vaccinia virus: effects of interferon on viral replication and spread. Virology. 341 (2), 284-300 (2005).
- Rozelle, D. K., Filone, C. M., Dower, K., Connor, J. H. Vaccinia reporter viruses for quantifying viral function at all stages of gene expression. Journal of Visualizes Experiments. (87), e51522 (2014).
- Cao, C., et al. Characterization of the transcriptome of the Asian gypsy moth Lymantria dispar identifies numerous transcripts associated with insecticide resistance. Pesticide Biochemistry and Physiology. 119, 54-61 (2015).
- Sparks, M. E., Blackburn, M. B., Kuhar, D., Gundersen-Rindal, D. E. Transcriptome of the Lymantria dispar (gypsy moth) larval midgut in response to infection by Bacillus thuringiensis. PloS One. 8 (5), e61190 (2013).
- Sparks, M. E., Gundersen-Rindal, D. E. The Lymantria dispar IPLB-Ld652Y cell line transcriptome comprises diverse virus-associated transcripts. Viruses. 3 (11), 2339-2350 (2011).
- Lin, G., Li, G., Granados, R. R., Blissard, G. W. Stable cell lines expressing baculovirus P35: resistance to apoptosis and nutrient stress, and increased glycoprotein secretion. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 37 (5), 293-302 (2001).
- Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).
- Kanost, M. R., et al. Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).
- Paixao, E. S., Teixeira, M. G., Rodrigues, L. C. Zika, chikungunya and dengue: the causes and threats of new and re-emerging arboviral diseases. BMJ Global Health. 3, (2018).
