Araçlar Viral Immunomodulators ve ana bilgisayar Antiviral faktörler tanımlanması için eleme olarak Abdovirüs enfeksiyonlar
Summary
Burada, Abdovirüs çoğaltma ve Abdovirüs çoğaltma kısıtlamak 2) ökaryotik ana faktörler teşvik 1) virüs kodlanmış immunomodulators tanımlamak için protokolleri mevcut. Floresan ve ışıldama dayalı yöntemlerin araştırmacılar hızla düşük sinyal noise oranları ile basit deneyleri Abdovirüs çoğaltma nicel veriler elde etmek için izin verir.
Abstract
RNA müdahale – ve genom düzenleme-tabanlı platformlar tarama virüs çoğaltma kısıtlamak konak hücre faktörleri tanımlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, bu ekranlar genellikle viral patojen altında eğitim için doğal olarak keyfi olan hücreler yapılmaktadır. Bu nedenle, virüs denetimi koşullarında güçlü çoğaltma bu ekranlar dinamik aralığını sınırlayabilir. Ayrıca, bu ekranlar virüs çoğaltma virüs iyi adapte ana bilgisayara ve antiviral savunma mücadele yeteneğine ise sınırlandıran hücresel savunma yolları kolayca belirleyemiyor olabilir. Bu makalede, biz arboviruses gibi vesicular Stomatit virüs (VSV) tarafından üzerinde doğal olarak başarısız enfeksiyonlar virüs-ana etkileşimler merkezi ekranlar aracılığıyla keşfetmek için yeni bir paradigma tanımlamak. Çeşitli dipteran böcek ve memeli ev sahibi çoğaltmak yeteneği VSV rağmen VSV Lepidoptera böcekler, gypsy moth (Lymantria dispar) gibi türetilmiş hücre hatları çeşitli sonrası giriş, başarısız bir enfeksiyon uğrar. “Ne zaman konak hücre antiviral Savunma virüs olduğundan Ancak, bunlar abes VSV hastalık kurtarıldı”. Biz nasıl VSV kodlama uygun reporter genler ve kısıtlayıcı L. dispar suşları tarif hücre hatları ana faktörler Abdovirüs sınırlama içinde katılan tanımlamak için kurulum ekranları için eşleştirilmiş. Ayrıca, biz de bu tarama araçları yarar VSV çoğaltma veya ektopik ifade memeli virüsler tarafından kodlanmış dahil olmak üzere, coinfection sırasında kurtarma virally kodlanmış faktörler tanımlaması gösterir. L. dispar hücrelerdeki VSV çoğaltma doğal sınırlamasının VSV kurtarma, böylece izlemek için basit ışıma ve floresan tabanlı deneyleri kullanımını teşvik koşulları için eleme yüksek sinyal gürültü oranı sağlar VSV çoğaltma değişiklikleri. Bu metodolojileri ana bilgisayar antiviral yanıt ve viral bağışıklık kaçırma faktörler arasındaki etkileşimi anlamak için değerlidir.
Introduction
Bir virüs verimli belirli bir ana çoğaltmak yeteneği kısmen destek viral giriş ve çoğaltma1konak hücre faktörler kullanılabilirlik tarafından yönetilmektedir. Aksi takdirde viral çoğaltma2,3engel olur sayaç hücresel antiviral savunma için bir virüs kapasitesi tarafından virüs ana bilgisayar aralığı da dikte. Sonuçta bir virüs yaşam döngüsünün belirli bir ana içinde tamamlamak mümkün olacak olup olmadığını karar bu karmaşık virüs-ana etkileşimler sonucu olur. Eğer viral çoğaltma ensues ana bilgisayara ilişkin potansiyel patojenik sonuçları göz önüne alındığında, bu abes ve üretken arasındaki dengeyi ipucu anahtar virüs-ana etkileşimler anlayışımız daha fazla için deneysel stratejiler geliştirmek için önemlidir enfeksiyonlar. Virüs ana bilgisayar etkileşimi moleküler özelliklerinin elucidating yeni ve alternatif antiviral tedavi stratejilerinin geliştirilmesi vesile olacaktır.
RNA müdahale (RNAi)4,ve advent ile5 ve genom düzenleme araçları (Örn., CRISPR-Cas9, çinko parmak nükleaz, TALENs)6,7, değiştirmek için deneysel olarak mümkün olmuştur hücresel genom çapında faktörlere ifade ölçekler ve virüs çoğaltma hakkında bu değişiklikleri etkisini keşfedin. Gerçekten de, çok sayıda RNAi ve ekranlar genom-düzenleme-tabanlı virüs-ana etkileşimler8,9,10, yeni esaslarını açıkladı omurgasız ve omurgalı konak hücre tiplerinde yapılmıştır 11 , 12. bu ekranlar genellikle gazetecilere, ateş böceği luciferase (LUC) veya floresan proteinler gibi kodlama virüs istihdam (Örn., GFP, DsRed), bir okuma olarak viral gen ekspresyonu kantitatif değerlendirilmesi uygun aracı sağlayan viral çoğaltma9,12. Bu strateji araştırmacılar ya teşvik veya viral çoğaltma tarafından artar ya da azalır, sırasıyla kanıtlandığı düşman,9,12viral muhabiri sinyalleri ana faktörleri belirlemek için sağlar. Ancak, büyük çoğu durumda, bu ekranlar hangi onlar incelendiği ana hücre tipi iyi adapte virüs kullanılarak yapılmıştır. Bu strateji viral patojenler ve onların doğal ana bilgisayarlar arasında coevolutionary ilişkiler anlamak için önemli olabilir de, açığa çıkarmak ana bilgisayar antiviral faktörleri onların kullanımı ile ilgili temel sorunları teşkil etmez. Bu gibi durumlarda, bir donanım virüs muhabir olarak sinyal RNAi nakavt için baktı ediliyor veya viral çoğaltma normalde engellemektedir hücresel bir faktör inactivation. İlk olarak, bir virüs zaten sağlam kontrol koşullar altında incelenmektedir ana bilgisayar hücredeki çoğaltmak mümkün ise (Örneğin, arka plan ve gelişmiş viral muhabir sinyalleri arasında ayrım yapmak yeteneği) ekranın dinamik alan sınırlı olabilir. İkinci olarak, bu sorun daha fazla virüs iyi adapte konak hücre ve içinde belgili tanımlık perde hedef alınmaktadır konak savunma yolları ortaya koydu, etkili olduğu durumlar tarafından bileşik olduğunu.
Eleme yöntemleri geleneksel virüs-ana bilgisayar etkileşimi ile ilgili yukarıdaki kaygıları nedeniyle doğal olarak başarısız Abdovirüs enfeksiyonlar Lepidoptera böcek hücrelerinde yararlanmak virüs-ana etkileşimler çalışmak için yeni bir paradigma geliştirdik. Bu strateji iyi okudu insan Abdovirüs, VSV, gypsy moth (L. dispar)13türetilmiş hücrelerdeki abes bir enfeksiyon uğrar bir gözlem türetilmiştir. VSV doğal memeli ana dipteran böcekler (yani, kum sinekleri) tarafından iletilir ve deneysel olarak geniş bir omurgasız bulaştırmak için gösterilmiştir ve omurgalı konaklarda her iki14kültür ve in vivohücre. 11-kb olumsuz anlamda tek iplikçikli RNA genomu VSV her saran virion kadar yapmak proteinler çevriliyor beş subgenomic mRNA’ların kodlar. Ancak, VSV ters genetik sistemler çoğaltma yetkili suşları LUC veya floresan proteinler, ek olarak beş doğal VSV gen ürünleri15,16,17kodlama yaratılması için izin. Bu muhabir proteinler VSV virion dahil değil çünkü onlar sonrası giriş oluşur VSV gen ekspresyonu için uygun bir okuma sağlar. VSV suşları GFP veya LUC kodlama kullanarak, biz daha önce VSV gen ekspresyonu ciddi LD652 hücreleri girişte sınırlıdır ve VSV titreleri 72 saat sonrası enfeksiyon (HPI) artırmayın göstermiştir. Buna ek olarak, LD652 hücreleri VSV ve memeli poxvirus, vaksinia virüs (VACV), coinfection VSV gen ekspresyonu ve titreleri Logaritmik artar bu zaman noktası tarafından yol açar. VACV erken gen ekspresyonu, DNA ikileşmesi ve geç gen ekspresyonu LD652 hücre enfeksiyonlar geçer ama VACV çoğaltma döngüsü nedeniyle eksik virion morfogenetik18sonuçta başarısız. Büyük ~ 192 kb DNA genom VACV, bunların çoğu viral çoğaltma ana bilgisayar bağışıklık yanıtı19bastırılması yoluyla teşvik immunomodulatory özelliklerini görüntülemek > 200 protein kodlayan. Bu nedenle, biz bu VACV coinfection tarafından LD652 hücrelerdeki VSV çoğaltma “kurtarma” büyük olasılıkla L. dispar yanıt normalde VSV çoğaltma sınırlama inhibe VACV immunomodulators tarafından aracılı olan. Bu destek, ana bilgisayar RNA polimeraz II inhibitörü actinomycin D LD652 hücrelerle tedavi de LD652 hücrelerde transkripsiyon-bağımlı ana bilgisayar yanıt VSV çoğaltma sonrası giriş13blok gösteren VSV çoğaltma kurtarır.
Yukarıdaki gözlemleri VSV enfeksiyona LD652 hücrelerin doğal olarak kısıtlayıcı doğa nispeten düşük bir arka plan ne zaman muhabir VSV kodlu sinyalleri (yani, bu ana bilgisayar inhibe geliştirmek koşulları için eleme sağlayabilir öneririm Antiviral savunma). Burada, floresan veya LUC tabanlı deneyleri ekrana VSV kısıtlama Lepidoptera hücrelerdeki rahatlatmak koşulları için kullanma yöntemleri sağlamak. İlk olarak, bu deneyleri VSV kısıtlama aday viral etkenler ektopik ifade veya her iki coinfection deneyler sırasında break virally kodlanmış immunomodulatory faktörleri belirlemek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Örnek olarak, biz nasıl biz bu tarama teknikleri poxvirus kodlanmış A51R protein diğer poxvirus faktörler13yokluğunda VSV çoğaltma kurtarmak immunomodulatory faktörler yeni bir aile tanımlamak için kullanılan göstermektedir. İkinci olarak, RNAi kısıtlayıcı VSV-LD652 hücre enfeksiyonları eleme doğrudan ökaryotik ana faktörler Abdovirüs kısıtlama13‘ te katılan tanımlamak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada basit floresan ışıma-temelli ve deneyleri VSV çoğaltma kısıtlayıcı Lepidoptera hücre kültürlerinde kurtarmak koşulları için ekran anlatmıştık. Mükemmel bir sinyal-gürültü oranı VSV gen ekspresyonu için raporlaması VSV Lepidoptera hücrelerdeki abes enfeksiyon oluşturur. Örneğin, lysates–dan tek VSV-LUC hastalık tespit LU sinyalleri edildi ~ 1000 kat daha fazla daha yüksek lysates, sahte enfekte içinde bu sinyalleri sadece yaklaşık iki kat 72-h saat boyunca değişti. henüz. Buna …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.G. University of Texas Southwestern Tıp Merkezi donatılmış akademisyenler programdan fon tarafından desteklenmiştir. Yazar Michael Whitt (Tennessee Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi) ve Sean Whelan (Harvard Medical School) VSV-DsRed ve VSV-LUC sağlanması için teşekkür ederiz. Yazarlar ayrıca Gary Luker (Michigan Üniversitesi Tıp Fakültesi) VACV-FL-GFP zorlanma tür hediye için teşekkür ederiz.
Materials
| 6-well tissue culture plates | CELLTREAT | 229106 | |
| 24-well tissue culture plates | CELLTREAT | 229124 | |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | C430167 | |
| Grace’s Insect Medium | Sigma | G8142 | |
| EX-CELL 420 | Sigma | 14420C | |
| Fetal Bovine Serum – Optima | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| Growth medium | 1:1 mixture of Grace's Insect Medium and EX-Cell 420 Serum-Free Medium also containing 1 % antibiotic-antimycotic solution and 10 % Fetal bovine serum | ||
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100×) | Sigma | A5955 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma | D8662 | |
| Serum Free Media (SFM) | Thermo Fisher | 10902096 | |
| Cytosine arabinoside | Sigma | C1768 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 10362100 | |
| Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Corning | 25950CQC | |
| Reporter lysis buffer 5X | Promega | E3971 | |
| Luciferase Assay Reagent | Promega | E1483 | |
| 96-Well Microplates | Corning | 3915 | |
| Mouse anti-FLAG antibody | Wako | 014-22383 | |
| Rabbit anti-firefly luciferase antibody | Abcam | ab21176 | |
| Mouse anti-actin antibody | Sigma | A2066 | |
| Mouse anti-VSV M | N/A | N/A | Dr. John Connor (Boston University) |
| Mouse anti-VACV I3L | N/A | N/A | Dr. David Evans (University of Alberta) |
| 8-well Chambered dish | Lab-Tek II | 155409 | |
| Cell viability dye | Thermo Fisher | C12881 | |
| FLUOstar microplate reader | BMG Labtech | FLUOstar | |
| Confocal microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
| Image analysis software | Olympus | v1.18 | cellSens software |
| Eppendorf 5702 ventilated centrifuge | Eppendorf | 22628102 | |
| Odyssey Fc Infrared Imaging System | Li-COR Biosciences | Odyssey Fc | |
| LD652 cells | N/A | N/A | Dr. Basil Arif (Natural Resources Canada) |
| BSC-40 cells | ATCC | CRL-2761 | |
| BHK cells | ATCC | CCL-10 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| BSC-1 cells | ATCC | CCL-26 | |
| in vitro transcription and purification kit | Thermo Fisher | AM1626 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 |
References
- Nomaguchi, M., Fujita, M., Miyazaki, Y., Adachi, A. Viral tropism. Frontiers in Microbiology. 3, 281 (2012).
- Werden, S. J., McFadden, G. The role of cell signaling in poxvirus tropism: the case of the M-T5 host range protein of myxoma virus. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1784 (1), 228-237 (2008).
- McFadden, G., Mohamed, M. R., Rahman, M. M., Bartee, E. Cytokine determinants of viral tropism. Nature Reviews: Immunology. 9 (9), 645-655 (2009).
- Silva, J. M., et al. Second-generation shRNA libraries covering the mouse and human genomes. Nature Genetics. 37 (11), 1281-1288 (2005).
- Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
- Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13 (6), 336-344 (2015).
- Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nature Reviews: Drug Discovery. 16 (6), 387-399 (2017).
- Hao, L., et al. Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication. Nature. 454 (7206), 890-893 (2008).
- Houzet, L., Jeang, K. T. Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis. Experimental Biology and Medicine. 236 (8), 962-967 (2011).
- Marceau, C. D., et al. Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens. Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).
- Savidis, G., et al. Identification of Zika Virus and Dengue Virus Dependency Factors using Functional Genomics. Cell Reports. 16 (1), 232-246 (2016).
- Panda, D., Cherry, S. Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions. Current Opinion in Virology. 2 (6), 784-792 (2012).
- Gammon, D. B., et al. A single vertebrate DNA virus protein disarms invertebrate immunity to RNA virus infection. Elife. 3, (2014).
- Letchworth, G. J., Rodriguez, L. L., Del cbarrera, ., J, Vesicular stomatitis. Veterinary Journal. 157 (3), 239-260 (1999).
- Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (18), 8388-8392 (1995).
- Cureton, D. K., Massol, R. H., Saffarian, S., Kirchhausen, T. L., Whelan, S. P. Vesicular stomatitis virus enters cells through vesicles incompletely coated with clathrin that depend upon actin for internalization. PLoS Pathogens. 5 (4), e1000394 (2009).
- Duntsch, C. D., et al. Recombinant vesicular stomatitis virus vectors as oncolytic agents in the treatment of high-grade gliomas in an organotypic brain tissue slice-glioma coculture model. Journal of Neurosurgery. 100 (6), 1049-1059 (2004).
- Li, Y., Yuan, S., Moyer, R. W. The non-permissive infection of insect (gypsy moth) LD-652 cells by Vaccinia virus. Virology. 248 (1), 74-82 (1998).
- Seet, B. T., et al. Poxviruses and immune evasion. Annual Review of Immunology. 21, 377-423 (2003).
- Cotter, C. A., Earl, P. L., Wyatt, L. S., Moss, B. Preparation of Cell Cultures and Vaccinia Virus Stocks. Current Protocols in Microbiology. 39, 11-18 (2015).
- Andrei, G., et al. Cidofovir resistance in vaccinia virus is linked to diminished virulence in mice. Journal of Virology. 80 (19), 9391-9401 (2006).
- Dascher, C., VanSlyke, J. K., Thomas, L., Balch, W. E., Thomas, G. Preparation of recombinant vaccinia virus for expression of small GTPases. Methods in Enzymology. , 174-188 (1995).
- Martin, A., Rex, E. A., Ishidate, T., Lin, R., Gammon, D. B. Infection of Caenorhabditis elegans with Vesicular Stomatitis Virus via Microinjection. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
- Luker, K. E., Hutchens, M., Schultz, T., Pekosz, A., Luker, G. D. Bioluminescence imaging of vaccinia virus: effects of interferon on viral replication and spread. Virology. 341 (2), 284-300 (2005).
- Rozelle, D. K., Filone, C. M., Dower, K., Connor, J. H. Vaccinia reporter viruses for quantifying viral function at all stages of gene expression. Journal of Visualizes Experiments. (87), e51522 (2014).
- Cao, C., et al. Characterization of the transcriptome of the Asian gypsy moth Lymantria dispar identifies numerous transcripts associated with insecticide resistance. Pesticide Biochemistry and Physiology. 119, 54-61 (2015).
- Sparks, M. E., Blackburn, M. B., Kuhar, D., Gundersen-Rindal, D. E. Transcriptome of the Lymantria dispar (gypsy moth) larval midgut in response to infection by Bacillus thuringiensis. PloS One. 8 (5), e61190 (2013).
- Sparks, M. E., Gundersen-Rindal, D. E. The Lymantria dispar IPLB-Ld652Y cell line transcriptome comprises diverse virus-associated transcripts. Viruses. 3 (11), 2339-2350 (2011).
- Lin, G., Li, G., Granados, R. R., Blissard, G. W. Stable cell lines expressing baculovirus P35: resistance to apoptosis and nutrient stress, and increased glycoprotein secretion. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 37 (5), 293-302 (2001).
- Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).
- Kanost, M. R., et al. Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).
- Paixao, E. S., Teixeira, M. G., Rodrigues, L. C. Zika, chikungunya and dengue: the causes and threats of new and re-emerging arboviral diseases. BMJ Global Health. 3, (2018).
