वायरल Immunomodulators और मेजबान एंटीवायरल कारकों की पहचान के लिए स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में Arbovirus संक्रमण
Summary
यहाँ, हम प्रोटोकॉल arbovirus प्रतिकृति और 2) eukaryotic होस्ट कारक arbovirus प्रतिकृति को प्रतिबंधित करें जो का प्रचार 1) वायरस एन्कोडेड immunomodulators की पहचान करने के लिए प्रस्तुत है । इन प्रतिदीप्ति-और luminescence आधारित तरीकों शोधकर्ताओं तेजी से कम संकेत करने के लिए शोर अनुपात के साथ सरलीकृत परख में arbovirus प्रतिकृति के मात्रात्मक readouts प्राप्त करने के लिए अनुमति देते हैं ।
Abstract
आरएनए हस्तक्षेप-और जीनोम संपादन-आधारित स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म व्यापक रूप से वायरस प्रतिकृति प्रतिबंधित होस्ट सेल कारकों की पहचान करने के लिए उपयोग किया गया है । हालांकि, इन स्क्रीन आमतौर पर अध्ययन के तहत वायरल रोगज़नक़ के लिए स्वाभाविक रूप से स्वतंत्र हैं कि कोशिकाओं में आयोजित की जाती हैं । इसलिए, संतुलित प्रतिकृति वायरस नियंत्रण स्थितियों में इन स्क्रीन की डायनेमिक श्रेणी सीमित हो सकता है । इसके अलावा, इन स्क्रीन आसानी से सेलुलर रक्षा रास्ते है कि वायरस प्रतिकृति प्रतिबंधित अगर वायरस अच्छी तरह से मेजबान के लिए अनुकूलित और एंटीवायरल गढ़ का मुकाबला करने में सक्षम है की पहचान करने में असमर्थ हो सकता है । इस अनुच्छेद में, हम स्क्रीन के उपयोग के माध्यम से वायरस मेजबान बातचीत की खोज के लिए एक नए प्रतिमान का वर्णन है कि arboviruses जैसे vesicular stomatitis वायरस (VSV) द्वारा स्वाभाविक रूप से सत्तासीन संक्रमण पर केंद्र । dipteran कीट और स्तनधारी मेजबान की एक विस्तृत श्रृंखला में दोहराने के लिए VSV की क्षमता के बावजूद, VSV इस तरह के जिप्सी कीट (lepidopteran असमानता) के रूप में Lymantria कीड़ों से व्युत्पंन सेल लाइनों की एक किस्म में एक के बाद प्रवेश, गर्भपात का एक प्रकार है । हालांकि, इन सत्तासीन VSV संक्रमण हो सकता है “बचाया” जब मेजबान सेल एंटीवायरल गढ़ से छेड़छाड़ कर रहे हैं । हम का वर्णन कैसे VSV उपभेदों सुविधाजनक रिपोर्टर जीन एंकोडिंग और प्रतिबंधक एल असमानता सेल लाइनों को स्थापित किया जा सकता है सेट अप स्क्रीन arbovirus प्रतिबंध में शामिल मेजबान कारकों की पहचान । इसके अलावा, हम भी वायरल इनकोडिंग कारकों की पहचान में इन स्क्रीनिंग उपकरण की उपयोगिता दिखाने के coinfection के दौरान या अस्थानिक अभिव्यक्ति के माध्यम से बचाव VSV प्रतिकृति, स्तनधारी वायरस द्वारा इनकोडिंग उन सहित । VSV प्रतिकृति के प्राकृतिक प्रतिबंध में L. असमानता कोशिकाओं एक उच्च संकेत करने के लिए शोर अनुपात प्रदान करता है जब शर्तों है कि VSV बचाव को बढ़ावा देने के लिए स्क्रीनिंग, इस प्रकार सरलीकृत luminescence के उपयोग को सक्षम करने और प्रतिदीप्ति-परख पर नजर रखने के आधार VSV प्रतिकृति में परिवर्तन । इन तरीकों में मेजबान एंटीवायरल प्रतिक्रियाओं और वायरल प्रतिरक्षा चोरी कारकों के बीच एक साथ खेलना समझने के लिए मूल्यवान हैं ।
Introduction
एक वायरस की क्षमता उत्पादक किसी विशेष होस्ट में दोहराने के लिए वायरल प्रविष्टि और प्रतिकृति1का समर्थन होस्ट सेल कारकों की उपलब्धता के द्वारा नियंत्रित भाग में है । वायरस-मेजबान रेंज भी एक वायरस की क्षमता से तय किया जा सकता है सेलुलर एंटीवायरल गढ़ है कि अंयथा वायरल प्रतिकृति2,3बाधा होगी काउंटर । यह इन जटिल वायरस-मेजबान बातचीत का परिणाम है कि अंततः तय है कि एक वायरस एक विशेष रूप से मेजबान में अपने जीवन चक्र को पूरा करने में सक्षम हो जाएगा है । होस्ट के लिए संभावित रोगजनक परिणामों को देखते हुए यदि वायरल प्रतिकृति मग्न है, यह महत्वपूर्ण है प्रयोगात्मक रणनीतियों को विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण वायरस-मेजबान बातचीत है कि सत्तासीन और उत्पादक के बीच संतुलन टिप सकता है की हमारी समझ संक्रमण. Elucidating वायरस की आणविक सुविधाओं-मेजबान पुनरावृत्ति नए और वैकल्पिक एंटीवायरल चिकित्सकीय रणनीतियों के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई होगी ।
आरएनए हस्तक्षेप (RNAi)4,5 और जीनोम-संपादन उपकरण के आगमन के साथ (जैसे, CRISPR-Cas9, जस्ता फिंगर nucleases, TALENs)6,7, यह परिवर्तन करने के लिए संभव हो गया है जीनोम-वाइड तराजू पर सेलुलर कारकों की अभिव्यक्ति और वायरस प्रतिकृति पर इन परिवर्तन के प्रभाव का पता लगाने । दरअसल, कई RNAi और जीनोम-संपादन आधारित स्क्रीन invertebrate और हड्डीवाला मेजबान सेल प्रकार है कि वायरस के नए पहलुओं का अनावरण किया है में आयोजित किया गया है-मेजबान बातचीत8,9,10, 11 , 12. इन स्क्रीन आमतौर पर ऐसे फायर फ्लाई luciferase (ल्यूक) या फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे, GFP, DsRed), कि मात्रात्मक एक readout के रूप में वायरल जीन अभिव्यक्ति का आकलन करने का सुविधाजनक साधन प्रदान करने के रूप में रिपोर्टर एंकोडिंग वायरस को रोजगार वायरल प्रतिकृति के लिए9,12। इस रणनीति के शोधकर्ताओं मेजबान कारकों की पहचान करने के लिए अनुमति देता है कि या तो को बढ़ावा देने या बढ़ जाती है या घट जाती है, क्रमशः, वायरल रिपोर्टर संकेत9,12द्वारा सबूत के रूप में वायरल प्रतिकृति antagonize । हालांकि, मामलों की विशाल बहुमत में, इन स्क्रीन वायरस है कि मेजबान सेल प्रकार है जिसमें वे अध्ययन किया जा रहा है के लिए अच्छी तरह से अनुकूलित कर रहे है का उपयोग कर आयोजित किया गया है । हालांकि इस रणनीति वायरल रोगजनकों और उनके प्राकृतिक मेजबानों के बीच coevolutionary रिश्तों को समझने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है, यह मौलिक मेजबान एंटीवायरल कारकों में उनके उपयोग के बारे में चिंताओं मुद्रा करता है । इन मामलों में, RNAi पछाड़ना पर वायरस रिपोर्टर संकेत में एक वृद्धि के लिए देखा जा रहा है, या एक सेलुलर कारक है कि आम तौर पर वायरल प्रतिकृति बाधा उत्पंन की निष्क्रियता । पहले, अगर एक वायरस पहले से ही मजबूती से मेजबान सेल में दोहराने में सक्षम है नियंत्रण शर्तों के तहत जांच की जा रही है, स्क्रीन के गतिशील रेंज (यानी, पृष्ठभूमि और बढ़ाया वायरल रिपोर्टर संकेतों के बीच अंतर करने की क्षमता) सीमित हो सकता है । दूसरा, इस मुद्दे को और अधिक परिस्थितियों में वायरस मेजबान सेल के लिए अच्छी तरह से अनुकूलित है और मेजबान रक्षा रास्ते है कि स्क्रीन में लक्षित किया जा रहा है काउंटर पर प्रभावी द्वारा जटिल है ।
पारंपरिक वायरस-मेजबान संपर्क स्क्रीनिंग तरीकों के बारे में उपरोक्त चिंताओं के कारण, हम वायरस मेजबान बातचीत का अध्ययन है कि lepidopteran कीट कोशिकाओं में स्वाभाविक रूप से सत्तासीन arbovirus संक्रमण का दोहन करने के लिए एक नए प्रतिमान विकसित की है । इस रणनीति के एक अवलोकन से निकला है कि अच्छी तरह से अध्ययन मानव arbovirus, VSV, जिप्सी कीट (एल. असमानता)13से व्युत्पंन कोशिकाओं में एक सत्तासीन संक्रमण से गुजरता है । VSV स्वाभाविक रूप से स्तनधारी मेजबान के लिए dipteran कीड़ों (यानी, रेत मक्खियों) द्वारा फैलता है, और invertebrate और हड्डीवाला दोनों सेल संस्कृति में और vivo14में मेजबान की एक विस्तृत श्रृंखला को संक्रमित करने के लिए प्रयोग किया गया है दिखाया गया है । 11 केबी नकारात्मक भावना एकल-असहाय आरएनए जीनोम VSV encodes के पांच subgenomic mRNAs है कि प्रत्येक में अनुवाद कर रहे है प्रोटीन है कि ऊपर ढंक विरिअन बनाते हैं । हालांकि, VSV रिवर्स आनुवंशिक प्रणालियों प्रतिकृति सक्षम उपभेदों ल्यूक या फ्लोरोसेंट प्रोटीन के निर्माण के लिए अनुमति दी है, पांच प्राकृतिक VSV जीन उत्पादों के अलावा15,16,17। क्योंकि इन रिपोर्टर प्रोटीन VSV विरिअन में शामिल नहीं हैं, वे VSV जीन अभिव्यक्ति के लिए एक सुविधाजनक readout है कि पोस्ट-एंट्री होती है प्रदान करते हैं । GFP या ल्यूक कूटबंधन VSV उपभेदों का उपयोग करना, हम पहले से पता चला है कि VSV जीन अभिव्यक्ति गंभीर LD652 कोशिकाओं के प्रवेश पर प्रतिबंधित है और कि VSV titers ७२ घंटे के बाद संक्रमण (hpi) से वृद्धि नहीं है । इसके विपरीत, VSV के साथ LD652 कोशिकाओं के coinfection और स्तनधारी poxvirus, vaccinia वायरस (VACV), इस समय बिंदु द्वारा दोनों VSV जीन अभिव्यक्ति और titers में लघुगणकीय वृद्धि की ओर जाता है. VACV जल्दी जीन अभिव्यक्ति, डीएनए प्रतिकृति, और LD652 कोशिका संक्रमण में देर जीन अभिव्यक्ति है, लेकिन VACV प्रतिकृति चक्र अंत में अपूर्ण विरिअन morphogenesis18के कारण सत्तासीन है । बड़े ~ १९२-केबी VACV encodes के डीएनए जीनोम > २०० प्रोटीन, जिनमें से कई इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गुण है कि मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं19के दमन के माध्यम से वायरल प्रतिकृति को बढ़ावा देने के प्रदर्शन । इसलिए, हम की कल्पना की है कि “बचाव” VACV coinfection द्वारा LD652 कोशिकाओं में VSV प्रतिकृति की संभावना VACV immunomodulators है कि बाधा एल द्वारा मध्यस्थता था कि आम तौर पर VSV प्रतिकृति सीमित प्रतिक्रियाओं । इस के समर्थन में, मेजबान आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय अवरोधक actinomycin डी के साथ LD652 कोशिकाओं का उपचार भी VSV प्रतिकृति LD652 कोशिकाओं में बचाता है, यह दर्शाता है कि प्रतिलेखन-निर्भर मेजबान प्रतिक्रियाओं ब्लॉक VSV प्रतिकृति पोस्ट-प्रविष्टि13.
उपरोक्त टिप्पणियों का सुझाव है कि स्वाभाविक रूप से प्रतिबंधात्मक प्रकृति LD652 कोशिकाओं VSV संक्रमण के लिए एक अपेक्षाकृत कम पृष्ठभूमि प्रदान कर सकता है जब शर्तों कि VSV-इनकोडिंग रिपोर्टर संकेतों को बढ़ाने के लिए स्क्रीनिंग (यानी, उन है कि मेजबान को बाधित एंटीवायरल ठोंकी). यहां, हम प्रतिदीप्ति या ल्यूक-आधारित परख का उपयोग करने के लिए शर्तों के लिए स्क्रीन है कि lepidopteran कोशिकाओं में VSV प्रतिबंध से राहत देने के लिए तरीके प्रदान करते हैं । सबसे पहले, हम बताते है कि कैसे इन परख को वायरल इनकोडिंग इम्यूनोमॉड्यूलेटरी कारकों की पहचान है कि या तो coinfection प्रयोगों के दौरान या उंमीदवार वायरल कारकों की अस्थानिक अभिव्यक्ति के माध्यम से VSV प्रतिबंध तोड़ने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक उदाहरण के रूप में, हम वर्णन कैसे हम इन स्क्रीनिंग तकनीक का इस्तेमाल इम्यूनोमॉड्यूलेटरी कारकों का एक नया परिवार के रूप में poxvirus इनकोडिंग A51R प्रोटीन की पहचान है कि बचाव अंय poxvirus कारकों13के अभाव में VSV प्रतिकृति । दूसरा, हम कैसे प्रतिबंधात्मक VSV-LD652 सेल संक्रमण में RNAi स्क्रीनिंग को सीधे arbovirus प्रतिबंध13में शामिल eukaryotic मेजबान कारकों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है वर्णन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम सरल प्रतिदीप्ति का वर्णन किया है-और luminescence आधारित परख शर्तों के लिए स्क्रीन करने के लिए कि बचाव प्रतिबंधात्मक lepidopteran सेल संस्कृतियों में VSV प्रतिकृति । lepidopteran कोशिकाओं में VSV के सत्तासीन संक्रमण एक उत…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.G. टेक्सास पश्चिमी मेडिकल सेंटर के संपंन विद्वानों कार्यक्रम विश्वविद्यालय से धन द्वारा समर्थित था । लेखक माइकल Whitt (टेनेसी स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र के विश्वविद्यालय) और शॉन Whelan (हार्वर्ड मेडिकल स्कूल) VSV-DsRed और VSV-ल्यूक के प्रावधान के लिए धंयवाद । लेखक भी गैरी लुकेर (मिशिगन मेडिकल स्कूल के विश्वविद्यालय) VACV-FL-GFP तनाव के प्रकार के उपहार के लिए धंयवाद ।
Materials
| 6-well tissue culture plates | CELLTREAT | 229106 | |
| 24-well tissue culture plates | CELLTREAT | 229124 | |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | C430167 | |
| Grace’s Insect Medium | Sigma | G8142 | |
| EX-CELL 420 | Sigma | 14420C | |
| Fetal Bovine Serum – Optima | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| Growth medium | 1:1 mixture of Grace's Insect Medium and EX-Cell 420 Serum-Free Medium also containing 1 % antibiotic-antimycotic solution and 10 % Fetal bovine serum | ||
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100×) | Sigma | A5955 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma | D8662 | |
| Serum Free Media (SFM) | Thermo Fisher | 10902096 | |
| Cytosine arabinoside | Sigma | C1768 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 10362100 | |
| Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Corning | 25950CQC | |
| Reporter lysis buffer 5X | Promega | E3971 | |
| Luciferase Assay Reagent | Promega | E1483 | |
| 96-Well Microplates | Corning | 3915 | |
| Mouse anti-FLAG antibody | Wako | 014-22383 | |
| Rabbit anti-firefly luciferase antibody | Abcam | ab21176 | |
| Mouse anti-actin antibody | Sigma | A2066 | |
| Mouse anti-VSV M | N/A | N/A | Dr. John Connor (Boston University) |
| Mouse anti-VACV I3L | N/A | N/A | Dr. David Evans (University of Alberta) |
| 8-well Chambered dish | Lab-Tek II | 155409 | |
| Cell viability dye | Thermo Fisher | C12881 | |
| FLUOstar microplate reader | BMG Labtech | FLUOstar | |
| Confocal microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
| Image analysis software | Olympus | v1.18 | cellSens software |
| Eppendorf 5702 ventilated centrifuge | Eppendorf | 22628102 | |
| Odyssey Fc Infrared Imaging System | Li-COR Biosciences | Odyssey Fc | |
| LD652 cells | N/A | N/A | Dr. Basil Arif (Natural Resources Canada) |
| BSC-40 cells | ATCC | CRL-2761 | |
| BHK cells | ATCC | CCL-10 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| BSC-1 cells | ATCC | CCL-26 | |
| in vitro transcription and purification kit | Thermo Fisher | AM1626 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 |
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