Efficace et évolutive différenciation dirigée de cliniquement compatibles cornéenne limbique épithéliales cellules souches à partir des cellules souches pluripotentes humaines
Summary
Ce protocole présente une méthode simple en deux étapes afin de différencier les cellules souches épithéliales cornéennes limbique de cellules souches pluripotentes humaines dans des conditions de culture acellulaire xeno – et chargeur. Les méthodes de culture cellulaire présentés ici permettent une production rentable, à grande échelle des cellules qualité clinique applicables à l’utilisation de la thérapie des cellules cornéenne.
Abstract
Cellules souches épithéliales limbique cornée (LESCs) sont responsables de la renouveler en permanence l’épithélium cornéen et maintenant ainsi l’homéostasie cornéenne et une clarté visuelle. Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC)-LESCs dérivées fournissent une source prometteuse de la cellule pour la thérapie de remplacement de cellules cornéennes. Conditions de culture et de la différenciation indéfinies, xénogéniques provoquent des variations dans les résultats de la recherche et entravent la traduction clinique de produits thérapeutiques dérivés de hPSC. Ce protocole prévoit une méthode reproductible et efficace pour la différenciation hPSC-LESC conditions xeno – et chargeur acellulaire. Tout d’abord, culture monocouche de hPSC indifférenciée sur recombinant laminin-521 (LN-521) et moyen défini hPSC sert de base pour une production robuste de haute qualité de matière première pour des différenciations. Deuxièmement, une méthode de différenciation rapide et simple hPSC-LESC donne des populations LESC en seulement 24 jours. Cette méthode comprend une induction surface ectodermique de quatre jours en suspension avec des petites molécules, suivie par phase de culture adhérent sur matrice de combinaison de LN-521/collagène IV dans un milieu défini différenciation épithéliale cornéenne. Cryostoring prolongée différenciation purifie la population cellulaire et permet aux banques de cellules de grandes quantités de produits de thérapie cellulaire. Les qualité qui en résulte hPSC-LESCs fournissent une stratégie de nouveau traitement potentiel pour la reconstruction de surface cornéenne traiter l’insuffisance limbique des cellules souches (LSCD).
Introduction
La cornée transparente à la surface oculaire permet à la lumière d’entrer dans la rétine et fournit la majorité du pouvoir de réfraction de le œil. La couche la plus externe, l’épithélium cornéen stratifié, est continuellement régénérée par les cellules souches épithéliales limbique (LESCs). Les LESCs se trouvent dans la couche basale des niches limbique à la jonction de corneoscleral1,2. LESCs n’ont pas des marqueurs spécifiques et uniques, donc leur identification nécessite une analyse plus approfondie d’un ensemble de marqueurs putatifs. Épithéliales transcription factor p63 et surtout en position N-terminale tronquée transcription de l’isoforme alpha de p63 (ΔNp63α), a été proposé comme une pertinente positive LESC marqueur3,4. Une répartition asymétrique des LESCs permet à se renouveler, mais également produire la progéniture qui migrent de façon centripète et vers l’avant. Comme les cellules des progrès vers la surface de la cornée ils progressivement perdre leurs stemness et enfin faire la différence en phase terminale à des cellules malpighiennes superficielles qui sont constamment perdus de la surface de la cornée.
Dommages à l’une des couches cornéens peuvent mener à la déficience visuelle grave, et défauts cornéens sont donc une des principales causes de cécité dans le monde entier. Dans insuffisance limbique des cellules souches (LSCD), le limbe est détruite par une maladie ou un traumatisme qui mène à conjunctivalization et opacification de la surface de la cornée et la perte de vision5,6. Thérapie de remplacement de cellules à l’aide de greffes limbique autologues ou allogéniques propose une stratégie thérapeutique pour les patients atteints LSCD4,7,8,9. Toutefois, récolte des greffes autologues porte un risque de complications à le œil sain et tissu du donneur est en bref l’approvisionnement. Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs), spécifiquement les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSCs), peut servir comme une source illimitée de types de cellules cliniquement pertinents, y compris les cellules épithéliales cornéennes. Par conséquent, LESCs dérivé de hPSC (hPSC-LESCs) représentent une source de cellule nouveau attrayant pour la thérapie de remplacement de cellules oculaires.
Traditionnellement, des méthodes de culture hPSC indifférencié et leurs protocoles de différenciation à LESCs sont sont appuyés sur l’utilisation de cellules nourricières indéfini, sérums animaux, milieux conditionnés ou membranes amniotiques10,11, 12 , 13 , 14 , 15. récemment, les efforts vers des produits de thérapie cellulaire plus sûrs ont incité la recherche de plusieurs protocoles standardisés et xeno sans la culture et de la différenciation. Par conséquent, plusieurs méthodes définies et xeno-gratuit pour les cultures à long terme des hPSCs indifférencié sont maintenant disponibles dans le commerce16,17,18. Comme un continuum, différenciation dirigée en s’appuyant sur de hPSCs sort épithéliale cornéenne, les repères moléculaires des protocoles ont été récemment introduits19,20,21,22, 23. Encore bon nombre de ces protocoles utilisés soit hPSCs chargeur basé indéfini, comme matériau, ou des cocktails complexes, xénogéniques facteur de croissance pour la différentiation de départ.
Le but du présent protocole est de fournir un robuste et optimisé, xeno- et méthode de culture exempte d’alimentation hPSC et différenciation ultérieure à LESCs cornéens. Culture monocouche de pluripotentes hPSCs sur laminin-521 (LN-521) matrice dans un milieu défini, sans albumine hPSC (notamment essentiels 8 Flex) permet la production rapide de matière homogène de différenciations. Par la suite, un simple, stratégie de différenciation en deux étapes Guide hPSCs vers la surface ectodermique sort en suspension, suivie de différenciation adhérente à LESCs. Une population de cellules où > 65 % express ΔNp63α est obtenue dans les 24 jours. La xéno – et chargeur-un protocole d’entente a été testé avec plusieurs lignes de hPSC (CSEh et hiPSCs), sans aucune obligation pour l’optimisation spécifique de la cellule ligne. Les protocoles pour le week-end-gratuit maintenance, passage, cryostoring et hPSC-LESC phénotypage décrits ici permettent la production d’importants lots de qualité LESCs pour clinique ou des fins de recherche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le résultat escompté de ce protocole est la génération réussie et robuste de LESCs d’une suspension monocellulaire de hPSC FF environ 3,5 semaines. Comme l’épithélium cornéen se développe à partir de l’ectoderme de surface29, la première étape du protocole vise à hPSCs vers cette lignée de direction. Une induction courte 24h avec transformation antagoniste du facteur de croissance bêta (TGF-β) SB-505124 et bFGF sont utilisés pour induire la différenciation ectodermique, sui…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’étude a été financée par l’Académie de Finlande (numéro de licence 297886), le programme des pièces de rechange humaine de Tekes, l’Agence finlandaise de financement pour la technologie et l’Innovation, le œil finlandais et Tissue Bank Foundation et la Fondation culturelle finlandaise. Les auteurs remercient les techniciens de laboratoire biomédical Outi Melin, Hanna Pekkanen, Emma Vikstedt et Outi Heikkilä excellente assistance technique et de la contribution à la culture cellulaire. Professeur Katriina Aalto-Setälä est reconnu pour prévoyant la fourniture d’équipements pour l’imagerie de fluorescence de la hiPSC ligne utilisée et BioMediTech Imaging Core facility.
Materials
| Material/Reagent | |||
| 1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+ | Gibco | #14040-091 | |
| 1x DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Lonza | #17-512F/12 | |
| 100 mm cell culture dish | Corning CellBIND | #3296 | Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation |
| 12-well plate | Corning CellBIND | #3336 | Culture vessel format for IF samples |
| 24-well plate | Corning CellBIND | #3337 | Culture vessel format for IF samples |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | #31350-010 | |
| 6-well plate, Ultra-Low attachment | Corning Costar | #3471 | Culture vessel format for induction in suspension culture |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21202 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21206 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-goat Ig | ThermoFisher Scientific | #A-11057 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-10037 | Secondary antibody for IF |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF, human) | PeproTech Inc. | #AF-100-18B | Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution | BD Biosciences | #554722 | Fixation and permeabilization solution for flow cytometry |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | #554723 | Washing buffer for flow cytometry |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | #B0560 | |
| Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) | PeproTech Inc. | #120-05A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #A8022-100G | |
| Cytokeratin 12 antibody | Santa Cruz Biotechnology | #SC-17099 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 14 antibody | R&D Systems | #MAB3164 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 15 antibody | ThermoFisher Scientific | #MS-1068-P | Primary antibody for IF |
| CnT-30 | CELLnTEC Advanced Cell Systems AG | #Cnt-30 | Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation |
| Collagen type IV (human) | Sigma-Aldrich | #C5533 | Human placental collagen type IV |
| CoolCell LX Freezing Container | Sigma-Aldrich | #BCS-405 | |
| CryoPure tubes | Sarsted | #72.380 | 1.6 ml cryotube for hPSC-LESC cryopreservation |
| Defined Trypsin Inhibitor | Gibco | #R-007-100 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2858501 | |
| GlutaMAX | Gibco | #35050061 | |
| Laminin 521 | Biolamina | #Ln521 | Human recombinant laminin 521 |
| ΔNp63α antibody | BioCare Medical | #4892 | Primary antibody for IF |
| OCT3/4 antibody | R&D Systems | #AF1759 | Primary antibody for IF |
| p63α antibody | Cell Signaling Technology | #ACI3066A | Primary antibody for IF |
| p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate) | Cell Signaling Technology | #56687 | p63-α PE-conjugated antibody for flow cytometry |
| PAX6 antibody | Sigma-Aldrich | #HPA030775 | Primary antibody for IF |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | #17-602E | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | #158127 | Cell fixative for IF |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | #P36931 | DAPI mountant for hard mounting for IF |
| PSC Cryopreservation Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2644601 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | #12563-011 | |
| KnockOut Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | #10829018 | |
| KnockOut SR XenoFree CTS | Gibco | #10828028 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | #11140050 | |
| SB-505124 | Sigma-Aldrich | #S4696 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | #T8787 | Permeabilization agent for IF |
| VectaShield | Vector Laboratories | #H-1200 | DAPI mountant for liquid mounting for IF |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II | Tharmac | ||
| Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51 | Olympus |
References
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