TChIP-Seq: 細胞型特異エピゲノムのプロファイリング

Summary

タンデム クロマチンのステップバイ ステップ プロトコルについて述べる免疫沈降配列 (tChIP-Seq) 細胞型特異ゲノムワイドなヒストン修飾の解析を可能にします。

Abstract

エピジェネティック制御は、遺伝子発現の中心的な役割を果たしています。ヒストン修飾は、1960 年代に発見された、ので、その生理学的および病理学的機能が幅広く研究されています。確かに、次世代のディープ シーケンスと特定のヒストン修飾抗体を介してクロマチン免疫沈降 (チップ) の出現は遺伝子エピジェネティック制御の私達の眺めをもたらしました。逆に、組織は通常種類の多様な細胞で構成されて、彼らの複雑な混合物の特定の細胞型のエピゲノムを調査する課題が分析。ゲノムワイドなセル型固有クロマチンの状態に対処するため我々 は最近セルからタグ ヒストン蛋白によるクロマチンの選択的浄化に基づいているタンデム クロマチン免疫沈降配列 (tChIP-Seq) を開発チップ以下続く金利の種類このプロトコルの目標は tChIP 以下のベスト ・ プラクティスの導入この手法は、組織固有のエピゲノム多様なヒストン修飾とそのモデル生物の調査のための多機能なツールを提供します。

Introduction

動物の組織は、多様な細胞の種類で構成されます。各細胞の遺伝子の規則では、セルの種類を定義します。クロマチン修飾 DNA メチル化とヒストン修飾、遺伝子発現の細胞型特異性の根底にあります。したがって、各細胞型におけるエピジェネティクス制御の測定が望まれているが、それは技術的な挑戦をされています。

特定のセル型でエピジェネティクスを調べるためには、タンデム クロマチン免疫沈降シーケンス (Seq tChIP) は最近開発された(図 1)¹だったTChIP、コアのエピトープ タグ ヒストン H2B は細胞型特異プロモーターから表されます。材料は種々 の細胞の混合物から開始されますが、この機能によりクロマチン興味のセルからの分離です。次チップ Seq-変更されたヒストン マークと次世代のディープ シーケンスを介してクロマチン精製 DNA を隔離した-我々 はゲノムワイドな標的細胞型のエピジェネティックな状態を監視できます。

この手法を使用すると、最近のヒストン H3 リジン 4 (H3K4me3) 蛋白質ニューロン固有トリメチルを調査したマーク。その研究では、Cre を介する組み換え (Rosa26^{CAG floxed pA H2B フラグ}) に表現された蛋白質の C 末端タグ付きのフラグ H2B のノックアウトのマウスを開発しました。CamK2a プロモーターの制御下で Cre 小胞体 (ER) の遺伝子を持つマウスとの交雑、による得られたマウス ラインはタモキシフェン注入 (Camk2a^{H2B フラグ})¹にアクティブなニューロンの H2B フラグを誘発しました。アンチ H3K4me3 抗体 tChIP Seq を行ったマウスの確立されたラインの脳から始まって、.H3K4me3 マークは、しばしばプロモーター領域に対応するのでニューロン¹特異的に発現する Mrna の何百もを見出す可能性があります。

ここでは、組織郭清からライブラリーの構築(図 1)へのステップをカバーする典型的な tChIP Seq 手法について述べる。この議定書の最終的な目標は、tChIP Seq のパフォーマンスと他のセルタイプおよびヒストンの修正にこのメソッドの将来のアプリケーションのためのベスト プラクティスを共有することです。

Protocol

記載のすべてのメソッドを理化学研究所 (H27-EP071) の安全部門によって承認し、関連するガイドラインと規制を実施します。 1. 組織切離 小さな断片に興味の組織を解剖 (約 < 3 mm2) 晴れた春のはさみを使用しています。注: 大きな組織片、凍結に時間がかかるし、より小さな部分が結果に影響を与える可能性がありますどちらのバッファーの大きいボリュ…

Representative Results

ここでは、我々 は組織切離、固定化、セル換散、タンデム精製クロマチンと次世代シーケンサーのための DNA ライブラリの準備について説明します。手順の中に 1 つは成功したシーケンスは、複数のステップ (図 2) で鍵である DNA の品質をテストできます。単一ヌクレオソームは、147 bp DNA 4で囲まれている通常、せん断の DNA は…

Discussion

我々 のプロトコル フラグ タグ H2B の式がタモキシフェン投与により誘導されるマウスの脳の神経細胞の最適化を行った。H2B 式、原料、組織および組織の量に使用プロモーターが成功 tChIP シーケンスの極めて重要なパラメーターしたがって、これらの要因の最適化は、興味のセル タイプごとに考慮されなければなりません。

このプロトコルに使用するプロシージャの間…

Materials

Protein LoBind tube, 2 mL	Eppendorf	No. 0030108132	For cell lysis
Protein LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	No. 0030108116	For ChIP and library preparation
DNA LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	No. 0030108051	For ChIP and library preparation
8-strip PCR tube	BIO-BIK	3247-00	For ChIP and library preparation
SK Mill	TOKKEN	SK-200	Handy cryogenic grinder to make cell powder for fixation
Metal bullet	TOKKEN	SK-100-DLC10	Accessory of SK Mill
2 mL stainless steel tube	TOKKEN	TK-AM5-SUS	An option for cell lysis
2 mL stainless steel tube holder	TOKKEN	SK-100-TL	An option for cell lysis
16% formaldehyde (w/v), methanol-free	Pierce	28906	To fix cells. Prepare 1% solution before use.
Glycine	Nacalai Tesque	17109-35	Prepare 2.5 M stock
D-PBS (-)(1x)	Nacalai Tesque	14249-24	For washing lysate and purified DNA
HEPES	Nacalai Tesque	02443-05	For Lysis buffer 1. Prepare 1 M, pH 7.5 stock.
5 M NaCl, molecular biology grade	Nacalai Tesque	06900-14	For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer
0.5 M EDTA, molecular biology grade	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	311-90075	For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer
Glycerol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	072-04945	For lysis buffer 1
NP-40	Nacalai Tesque	25223-75	For lysis buffer 1
Triton X-100, molecular biology grade	Nacalai Tesque	12967-32	For Lysis buffer 1
Tris	Nacalai Tesque	35406-91	For Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer. Prepare 1 M, pH 8.0 stock.
0.1 M EGTA pH neutral	Nacalai Tesque	08947-35	For Lysis Buffer 2
Protease inhibitor cocktail (100x)	Nacalai Tesque	25955-24	To block degradation of protein
RIPA buffer	Thermo Fisher Scientific	89900	For cell lysis and washing
milliTUBE 1 mL AFA Fiber	Covaris	520130	Sonicator tube. Accessory of Focused-ultrasonicator
Focused-ultrasonicator	Covaris	S220 or E220	To digest DNA into adequate size for ChIP-Seq
UltraPure 10% SDS	Thermo Fisher Scientific	15553-027	For ChIP Elution Buffer
RNase A	Nacalai Tesque	30141-14	To purify DNA from lysate
Proteinase K, recombinant, PCR Grade	Sigma-Aldrich	3115887001	To purify DNA from lysate
Ethanol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	054-07225	Make 70% solution
Monoclonal anti-FLAG M2 antibody produced in mouse	Sigma-Aldrich	F1804	To purify chromatin expressed in cells of interest
Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	11201D	This can be used for anti-FLAG IP and anti-H3K4me3 IP
Anti-tri-methyl histone H3 (K4), mouse monoclonal antibody	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	301-34811	Any other antibody that works for ChIP analysis will work
10x Blocking Reagent	Sigma-Aldrich	11096176001	For blocking during affinity purification
Denhardt’s solution	Nacalai Tesque	10727-74	For blocking during affinity purification
Glycogen (5 mg/ml)	Thermo Fisher Scientific	AM9510	To purify DNA from lysate
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q32866	For quantification of isolated DNA
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	For quantification of isolated DNA
0.5 mL tube	Axygen	10011-830	For quantification by Qubit
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)	Nacalai Tesque	25970-56	To purify DNA from lysate
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	SPRI magnetic beads for library preparation
Metal ice rack	Funakoshi	IR-1	To keep the cell lysate frozen
Sample Cooler	New England Biolabs	T7771S	Helps fix cells with minimal damage
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA	To check the quality of isolated DNA fragments. Another fragment analyzer can be used.
Bioanalyzer 2100 Expert Software	Agilent Technologies	G2946CA	Supplied with the Bioanalyzer
High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626	To check the quality of the isolated DNA fragments
KAPA LTP Library Preparation Kit	Roche	07961898001	Supplied with 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase, and PEG/NaCl solution
NEXTflex DNA Barcodes	BIOO Scientific	NOVA-514101	Adapter for library preparation. Supplied with DNA Barcode Adapters and Primer Mix.
KAPA Real-Time Library Amplification Kit	Roche	07959028001	Supplied with 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix, and Fluorescent Standards
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Roche	KM2602	For library preparation. Additionally, this enzyme may be required for the KAPA Real-Time Library Amplification Kit
Buffer EB	Qiagen	19086	10 mM Tris-Cl, pH 8.5 for elution of DNA
386-well qPCR plate	Thermo Fisher Scientific	4309849	For real-time PCR
QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4485701	To quantify DNA
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	For real-time PCR
MicroAmp Clear Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4306311	For plate sealing
End-repair master mix			Combine 1.4 µL of 10x KAPA End Repair Buffer, 1 µL of KAPA End Repair Enzyme Mix, and 1.6 µL of H2O
A-taling master mix			Combine 1 µL of KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 µL of KAPA A-Tailing Enzyme, and 8.4 µL of H2O
Ligation buffer mix			Combine 2 µL of KAPA ligation buffer and 6 µL of H2O
Real-time PCR master mix			Combine 5 µL of 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0.35 µL of PCR Primer Mix (10 µM each of forward primer AATGATACGGCGACCACCGAG and reverse primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), and 3.15 µL of H2O
PCR master mix			Combine 10 µL of 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 µL of PCR Primer Mix, and 0.6 µL of H2O
Integrative Genomics Viewer	Broad Institute	IGV_2.3.88	Genome browser to visualize sequencing data
DNA olgionucleotide: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′	Eurofins Genomics		A primer to amplify the promoter region of GAPDH
DNA olgionucleotide: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′	Eurofins Genomics		A primer to amplify the promoter region of GAPDH
SYBR Premix Ex Taq	Takara	RR420L	To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region
Thermal Cycler Dice	Takara	TP870	To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region